從抗生素作用機(jī)理探討其在轉(zhuǎn)基因植物篩選中的應(yīng)用

王梅霞

摘要：介紹了抗生素的種類及作用機(jī)理，探討了抗生素在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用，從原理上分析了植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中抗性標(biāo)記基因選擇的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：抗生素 轉(zhuǎn)基因植物 作用機(jī)理 抗性標(biāo)記

中圖分類號：Q-49 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：E

基因工程是高中生物學(xué)選修教材中非常重要的內(nèi)容，在近幾年的高考考題中也占有不小的比重。但教材中對于基因工程的操作及原理介紹得略顯單薄。下面就抗生素抗性基因在轉(zhuǎn)基因植物篩選中的作用進(jìn)行探討，希望能夠?qū)Ρ静糠纸虒W(xué)提供一些幫助。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指把從動物、植物或微生物中分離到的目的基因通過各種方法轉(zhuǎn)移到植物的基因組中，使之穩(wěn)定遺傳并賦予植物新的性狀，如抗蟲、抗病、抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)。該技術(shù)的實施至少需要三種工具：準(zhǔn)確切割DNA的“手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶;將DNA片段再連接起來的“縫合針”——DNA連接酶;將體外重組好的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的“運(yùn)輸工具”——運(yùn)載體。而運(yùn)載體上的標(biāo)記基因如抗生素抗性基因則可以幫助操作者將成功導(dǎo)入目的基因的受體細(xì)胞篩選出來。標(biāo)記基因的選擇對于基因工程的成功至關(guān)重要，在實際操作中必須依據(jù)抗生素的作用機(jī)理和受體細(xì)胞的生物學(xué)特性選擇合適的抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因。

1抗生素

抗生素是指由微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產(chǎn)物?？股丶炔粎⑴c構(gòu)成細(xì)胞結(jié)構(gòu)，也不是細(xì)胞的貯存養(yǎng)料;對產(chǎn)生菌本身無害，但能干擾其他活細(xì)胞的生長和發(fā)育?？股卦谂R床醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有廣泛的應(yīng)用。

1.1抗生素的種類

抗生素種類繁多，現(xiàn)己發(fā)現(xiàn)的多達(dá)數(shù)千種。按其化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同可分為：

①糖的衍生物，又稱為氨基糖苷類抗生素，在其分子結(jié)構(gòu)中都有1個氨基環(huán)醇環(huán)和1個或多個氨基糖分子，如鏈霉素、卡那霉素。

②多肽類抗生素，主要或全部由氨基酸組成，有多肽或蛋白質(zhì)的某些特性，如多黏菌素、青霉素。

③多烯類抗生素，分子結(jié)構(gòu)中有多個雙鍵，如制霉菌素、兩性霉素。

④大環(huán)內(nèi)酯抗生素，由一個或多個單糖組成并與碳鏈一起形成一個巨大的芳香內(nèi)酯類化合物，如紅霉素。

⑤四環(huán)類抗生素，都具有四個縮合苯環(huán)，如四環(huán)素。

⑥嘌呤類抗生素，都含有嘌呤環(huán)，如嘌呤霉素。

1.2抗生素的抗菌機(jī)理

抗生素的作用機(jī)制主要有：

①抑制細(xì)胞壁的合成，如青霉素。

②與細(xì)胞膜相互作用，破壞細(xì)胞膜的功能，使細(xì)菌破裂，如多黏菌素。

③抑制蛋白質(zhì)的合成，如四環(huán)素。

④干擾核酸代謝，如利福平。

1.2.1抑制細(xì)胞壁的合成

細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由多糖、蛋白質(zhì)和類脂類構(gòu)成，具有維持形態(tài)、抵抗?jié)B透壓變化等功能。因此，抑制細(xì)胞壁的合成會導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞破裂而死亡;動物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，植物和真菌雖然有細(xì)胞壁，但其成分和細(xì)菌細(xì)胞壁有很大不同，所以不受這些藥物的影響。細(xì)菌細(xì)胞壁含有青霉素結(jié)合蛋白，β-內(nèi)酰胺類抗生素能和這種蛋白結(jié)合，從而抑制細(xì)胞壁的合成。此類抗生素主要包括青霉素類和頭孢菌素類。

1.2.2與細(xì)胞膜相互作用，破壞細(xì)胞膜的功能，使細(xì)菌破裂

一些抗生素可以與細(xì)菌的細(xì)胞膜相互作用而影響膜的滲透性，使菌體內(nèi)鹽類離子、蛋白質(zhì)、核酸和氨基酸等重要物質(zhì)外漏，最終嚴(yán)重影響細(xì)菌的生命活動，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。例如，多黏菌素B以細(xì)菌外膜上的脂多糖為主要靶標(biāo)，與其結(jié)合從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜紊亂，細(xì)胞破裂。值得注意的是，細(xì)菌細(xì)胞膜與人體細(xì)胞膜基本結(jié)構(gòu)有很多相似之處，因此這類抗生素對人有一定的毒性。此類抗生素主要包括多黏菌素和短桿菌素。

1.2.3干擾蛋白質(zhì)的合成

有些抗生素可以通過作用于細(xì)菌的核糖體，從而干擾菌體蛋白質(zhì)的合成。蛋白質(zhì)是生命活動的主要承擔(dān)者。干擾蛋白質(zhì)的合成意味著細(xì)胞存活所必需的酶不能被合成，細(xì)胞的生命活動將受到嚴(yán)重影響，甚至無法進(jìn)行。細(xì)菌的核糖體由50 S和30 S兩個亞基組成。其中，氨基糖苷類和四環(huán)素類抗生素能夠作用于30 S亞基，而氯霉素、大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素類等主要作用于50 S亞基，抑制蛋白質(zhì)合成的起始反應(yīng)、肽鏈延長過程和終止反應(yīng)。以這種方式作用的抗生素包括福霉素（放線菌素）類、氨基糖苷類（如卡那霉素、潮霉素、新霉素等）、四環(huán)素類（金霉素、土霉素、四環(huán)素）和氯霉素。

1.2.4抑制核酸復(fù)制和轉(zhuǎn)錄

抑制核酸的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，進(jìn)而阻止細(xì)胞分裂和/或所需酶的合成。例如，利福平可以與細(xì)菌RNA聚合酶p亞基結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄的起始，實現(xiàn)殺菌效果。再如新生霉素可以影響DNA聚合酶的作用，從而影響DNA合成。以這種方式作用的抗生素包括萘啶酸、二氯基吖啶、利福平和灰黃霉素（抑制真菌的核酸代謝）等。

2植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中常用的抗生素及作用

抗生素在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的主要作用有兩種：①作為抑菌劑，用于植物受體材料感染農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后的脫菌（去除農(nóng)桿菌）和防止雜菌污染。②抗生素在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中還可以用于篩選轉(zhuǎn)化體和檢測轉(zhuǎn)基因后代，稱作篩選劑。

2.1植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的抑菌劑

植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中常用的轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。該方法經(jīng)濟(jì)有效，迄今為止約80%的轉(zhuǎn)基因植物都是通過這種方法獲得的。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，農(nóng)桿菌的存在將會影響受體細(xì)胞的生長和發(fā)育，因此常用一定濃度的抗生素去除或抑制農(nóng)桿菌的生長，同時也可以防止其他雜菌的污染。通常向培養(yǎng)體系中添加青霉素類（羧芐青霉素、氨芐青霉素等）、頭孢霉素類（頭孢霉唑林鈉、頭孢霉哌酮鈉、頭孢拉定、頭孢霉西林鈉、頭孢霉曲松鈉等）和大環(huán)內(nèi)脂類（紅霉素、白霉素等）達(dá)到這一目的。

2.2植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的篩選劑

基因工程中轉(zhuǎn)化子的篩選通常借助于基因表達(dá)載體上的標(biāo)記基因。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)也不例外?？股乜剐曰蚴浅Ｓ玫倪z傳標(biāo)記基因。但是并不是所有的抗生素抗性基因都可以用于轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)化子的篩選。如青霉素抗性基因，該基因的導(dǎo)入將賦予受體細(xì)胞青霉素抗性，但是植物細(xì)胞本來就對青霉素具有抗性。因此在轉(zhuǎn)基因操作中要根據(jù)受體細(xì)胞的特性來選擇合適的抗性標(biāo)記基因。

轉(zhuǎn)基因植物中所用的抗生素抗性基因包括卡那霉素抗性基因（Kanr）（提供卡那霉素、新霉素抗性）、慶大霉素抗性基因（Gm'）（提供慶大霉素抗性）等。氨基葡萄糖苷類抗生素（卡那霉素、新霉素、潮霉素等）是常用的選擇劑。此類抗生素主要是通過作用于50 S核糖體亞基或30 S核糖體亞基，從而干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成。真核生物細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體由60 S和40 S兩個亞基組成，并不受上述抗生素的影響。但真核細(xì)胞的線粒體和葉綠體內(nèi)的核糖體因組成和細(xì)菌核糖體極為相似，會受到氨基葡萄糖苷類抗生素的影響。此類抗生素作用于無相關(guān)抗性的植物時，會影響植物葉綠體、線粒體部分蛋白質(zhì)的合成，從而影響植物的生長，甚至導(dǎo)致其死亡。而轉(zhuǎn)化子細(xì)胞因為遺傳標(biāo)記基因所賦予的抗性所以不受影響。例如，Kan^r編碼的產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶對氨基糖苷類抗生素具有抗性，從而解除抗生素對植物的毒性，抑制卡那霉素等與植物細(xì)胞內(nèi)葉綠體和線粒體核糖體結(jié)合，保證葉綠體和線粒體蛋白質(zhì)的正常。非轉(zhuǎn)基因植株由于缺乏該抗性，表現(xiàn)為植株綠色器官黃化或死亡。

3結(jié)語

綜上可知，在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中正確選擇抗性標(biāo)記及對應(yīng)的篩選劑，是建立在對抗生素作用機(jī)理及受體細(xì)胞生理特性的充分了解上的。否則，就是南轅北轍，永遠(yuǎn)也不能達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。