具有抗細(xì)菌黏附和殺菌雙重功能的(HA/CHI-Van)5涂層的制備

廖鑫，黃義星

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 骨科，浙江 溫州 325027）

內(nèi)植入物感染是骨科的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，給患者和社會(huì)帶來(lái)了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。據(jù)報(bào)道，在美國(guó)每年因植入物感染導(dǎo)致死亡的人數(shù)高達(dá)5.5萬(wàn)，用于治療植入物感染的費(fèi)用超過(guò)一千萬(wàn)美元[1]。傳統(tǒng)的臨床治療方法為全身應(yīng)用抗生素。全身用藥時(shí)，可能會(huì)因病灶處血液循環(huán)障礙和瘢痕組織的影響導(dǎo)致患處的抗生素濃度無(wú)法達(dá)到有效水平，從而影響抗感染效果，還會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的全身不良反應(yīng)。而且，細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生表型改變和代謝，從而對(duì)抗生素產(chǎn)生抵抗。本研究采用層層自組裝的技術(shù)制備(HA/CHIVan)5多層膜結(jié)構(gòu)，用于預(yù)防骨科內(nèi)植入物感染的發(fā)生。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑：透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）購(gòu)自濟(jì)南福瑞達(dá)生物化工有限公司；殼聚糖（chitosan，CHI）購(gòu)自上海阿拉丁工業(yè)公司；萬(wàn)古霉素（Vancomycin，Van）、LB肉湯購(gòu)自大連美倫生物技術(shù)有限公司；蘇木素伊紅染色液、PBS緩沖液、硅片、無(wú)水乙醇、聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；血平板購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；24孔板細(xì)胞爬片購(gòu)自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌購(gòu)自上海艾研生物科技有限公司；Live/Dead試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；SD大鼠購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2019-0009；克氏針購(gòu)自上海開(kāi)為醫(yī)藥科技有限公司；EDTA脫鈣液購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器：zeta電位儀購(gòu)自英國(guó)馬爾文儀器有限公司；SW-CJ醫(yī)用型超凈工作臺(tái)、孵箱、倒置熒光顯微鏡購(gòu)自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司；掃描電鏡（SEM）購(gòu)自天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司；醫(yī)用診斷X光機(jī)購(gòu)自北京普朗新技術(shù)有限公司；小動(dòng)物活體microCT影像系統(tǒng)購(gòu)自上海珀金埃爾默企業(yè)管理有限公司；硬組織切片機(jī)購(gòu)自西安藍(lán)茗醫(yī)療科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多層膜的制備：將PEI溶解在去離子水中，并攪拌過(guò)夜至2 mg/mL的濃度。制備濃度為0.005 mol/L 的醋酸溶液，并且將HA溶解于上述溶液中至終濃度為1 mg/mL。用相同的方法制備相同濃度的CHI溶液。然后，將Van溶解在上述CHI溶液中，攪拌過(guò)夜至終濃度為1 mg/mL(CHI-Van)。將基材（硅片、24孔板玻璃片、克氏針）放入250 mL燒杯中并加入100 mL無(wú)水乙醇，超聲處理10 min后，用去離子水清洗，以此為一個(gè)循環(huán)，反復(fù)清洗3遍后用高純氮將洗凈的基材吹干。將洗凈的基材放入提前配制的2 mg/mL 聚乙烯亞胺溶液中浸泡2 h后取出，用高純氮吹干，使基材的表面帶有穩(wěn)定的正電荷。然后將它們浸入HA溶液中15 min，隨后用乙酸緩沖液漂洗，漂洗后氮?dú)獯蹈?。然后根?jù)不同的組裝目的，將上述材料浸泡在CHI或CHI-Van溶液中15 min，然后進(jìn)行相同的漂洗和干燥程序，以此為一個(gè)雙層。重復(fù)該組裝過(guò)程，最后獲得(HA/CHI)n和(HA/CHI-Van)n（n代表組成的雙層數(shù)）多層膜結(jié)構(gòu)。

1.2.2 zeta電位的測(cè)定：取ps懸濁液1 mL置于 1.5 mL離心管中，離心機(jī)8 000 r/min下離心5 min，去除上清液，加入1 mL PEI，常溫下反應(yīng)15 min，吹打混勻，吸取100 μL加入1 mL PBS中測(cè)量zeta電位，將離心管內(nèi)剩余懸濁液離心機(jī)8 000 r/min下離心5 min，去除上清液，加入1 mL HA，常溫下反應(yīng)15 min，吹打混勻，吸取100 μL加入1 mL PBS中測(cè)量zeta電位，標(biāo)記為(HA/CHI-Van)0.5。將離心管內(nèi)剩余懸濁液離心機(jī)8 000 r/min下離心5 min，去除上清液，加入1 mL CHI-Van，常溫下反應(yīng)15 min，吹打混勻，吸取100 μL加入1 mL PBS中測(cè)量zeta電位，記為(HA/CHI-Van)1。以此類(lèi)推，連續(xù)測(cè)量5雙層，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 活細(xì)菌染色實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)中使用LIVE/DEAD BacLight細(xì)菌活力試劑盒測(cè)定細(xì)菌活力。其中SYTO9能對(duì)具有完整細(xì)胞膜的活細(xì)菌進(jìn)行染色，形成綠色熒光。該實(shí)驗(yàn)分成空白組和(HA/CHI)5組，取無(wú)菌24孔板細(xì)胞培養(yǎng)板，空白組放入未修飾空白玻璃片，(HA/CHI)5組放入經(jīng)(HA/CHI)5多層膜修飾的玻璃片，每組設(shè)置5個(gè)平行樣本，并做好標(biāo)記。每孔中加入1 mL金黃色葡萄球菌（102CFU/mL，LB肉湯稀釋?zhuān)?，?4孔板放入37 ℃恒溫孵箱中培養(yǎng)5 h。取出配制好的混合染料在室溫下解凍并打開(kāi)熒光顯微鏡預(yù)熱30 min。取出24孔板，將細(xì)菌液吸出，加入500 μL超純水，輕輕搖晃，反復(fù)清洗3次。加入200 μL配制的混合染料，避光培養(yǎng)15 min后，吸出染料，再用超純水清洗3遍，最后在避光條件下在熒光顯微鏡下觀察。將金黃色葡萄球菌換成大腸桿菌，實(shí)驗(yàn)條件不變，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟。

1.2.4 越獄實(shí)驗(yàn)：將24 孔板玻璃片分成空白組、(HA/CHI)5組和(HA/CHI-Van)5組?？瞻捉M放入未修飾空白玻璃片，(HA/CHI)5組放入經(jīng)(HA/CHI)5多層膜修飾的玻璃片，(HA/CHI-Van)5組放入經(jīng)(HA/CHIVan)5多層膜修飾的玻璃片。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段的新鮮金黃色葡萄球菌（濃度108CFU/mL）。將各組玻璃片分別置于瓊脂平板中間，吸取20 μL上述濃度菌液滴于玻璃片中間，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況。實(shí)驗(yàn)條件不變，用大腸桿菌重復(fù)上述實(shí) 驗(yàn)。

1.2.5 金黃色葡萄球菌的場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM）：準(zhǔn)備未修飾空白硅片、(HA/CHI)5和 (HA/CHI-Van)5多層膜修飾的硅片各3片，分組如上。分別浸入1 mL金黃色葡萄球菌（102CFU/mL，LB肉湯稀釋?zhuān)腋∫褐?，并?7 ℃下孵育8 h以使細(xì)菌生長(zhǎng)，將樣品用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液洗滌3次以除去未附著的細(xì)菌，然后用2.5%戊二醛固定12 h，通過(guò)一系列分級(jí)乙醇溶液（50%、70%、90%、100%）脫水，時(shí)間分別為2、1、1、2 h。將所有樣品烘干后，使用FE-SEM觀察。

1.2.6 動(dòng)物造模：本實(shí)驗(yàn)所用SD大鼠是由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，均為雄鼠，健康狀況良好，2月齡，體質(zhì)量（200±20）g。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，選擇精神狀態(tài)好，體質(zhì)量接近的大鼠，隨機(jī)分成3組，每組8只，水合氯醛麻醉后，用剃須刀剃毛，碘伏消毒，手術(shù)暴露脛骨平臺(tái)，在此過(guò)程中盡可能保留重要神經(jīng)、血管、韌帶組織。用0.8 mm克氏鉆頭垂直鉆入髓腔，鉆孔與脛骨平臺(tái)垂直，用無(wú)菌注射器吸出少量骨髓。將克氏針?lè)湃脬@孔內(nèi)，分為空白組、(HA/CHI-Van)5組、假手術(shù)組，前2組從鉆孔中注射10 μL金黃色葡萄球菌，假手術(shù)組不注射細(xì)菌，空白組和假手術(shù)組都采用沒(méi)有涂層的克氏針， (HA/CHI-Van)5組采用表面有(HA/CHI-Van)5多層膜修飾的克氏針。然后用骨蠟封閉鉆孔，逐層縫合，手術(shù)全過(guò)程注意無(wú)菌操作。待大鼠蘇醒后，隔離飼養(yǎng)，給予充足飼料和水，保持飼養(yǎng)環(huán)境干燥，每天觀察。

1.2.7 大鼠傷口觀察和骨髓腔細(xì)菌檢查：手術(shù)6周后處死所有大鼠，剪開(kāi)傷口皮膚，詳細(xì)檢查創(chuàng)口情況，然后打開(kāi)左下肢脛骨骨髓腔，用無(wú)菌注射器吸取少量骨髓液混合物，用LB肉湯進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng) 24 h后在血平板培養(yǎng)基上涂板培養(yǎng)。

1.2.8 X線(xiàn)檢查和評(píng)分：處死后馬上取大鼠大腿進(jìn)行X光片檢查，設(shè)置條件：電壓45 kV，電流250 mA， 曝光時(shí)間0.2 s。主要觀察大鼠大腿骨質(zhì)破壞，溶骨和周?chē)M織情況。接著我們邀請(qǐng)了3位骨科副主任醫(yī)師對(duì)X線(xiàn)檢查結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。根據(jù)脛骨感染的X射影像學(xué)檢查，評(píng)估了脛骨感染的嚴(yán)重程度[2]。評(píng)價(jià)區(qū)域：脛骨平臺(tái)和脛骨干。

1.2.9 CT檢查：X光片檢查結(jié)束后，剔除骨上附著的軟組織，立刻進(jìn)行CT檢查。我們將距離克氏針表面半徑為0.1 mm的環(huán)作為感興趣區(qū)（VOL）。分析左脛骨干髓端骨塊骨密度（bone mineral density，BMD）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV），并根據(jù)內(nèi)置軟件作出3D圖和柱狀圖。

1.2.10 骨組織HE染色：處死大鼠后，取其左脛骨干髓端病變骨塊，用4%多聚甲醛溶液固定48 h，隨后用EDTA脫鈣液進(jìn)行脫鈣，脫鈣完成后，進(jìn)行乙醇梯度脫水，二甲苯透明，軟蠟浸泡1.5 h，硬蠟浸泡1.5 h，包埋機(jī)包埋，完成石蠟塊。將蠟塊進(jìn)行組織切片并用HE染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以±s表示，多組比較用單采因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBS中各組裝過(guò)程的zeta電位變化 當(dāng)組裝第一層HA后，測(cè)得的電位為（-3.12±0.56）mV。繼續(xù)進(jìn)行CHI-Van組裝后，電位變?yōu)椋?0.67±0.69）mV。觀察可見(jiàn)，隨著組裝過(guò)程的進(jìn)行，每次組裝單層溶液后，測(cè)得的電位發(fā)生正負(fù)交替變化。見(jiàn)圖1。

圖1 在PBS溶液中不同組裝層數(shù)時(shí)的zeta電位

2.2 活細(xì)菌染色結(jié)果 結(jié)果顯示分別與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液接觸培養(yǎng)5 h后，空白組玻璃片表面均可以觀察到大量帶有綠色熒光的活細(xì)菌，但是(HA/CHI)5組玻璃片表面顯示綠色熒光的活細(xì)菌很少。見(jiàn)圖2。

2.3 金黃色葡萄球菌的越獄實(shí)驗(yàn)和掃描電鏡結(jié)果 培養(yǎng)4 d后，越獄實(shí)驗(yàn)顯示空白組玻璃片上的金黃色葡萄球菌大部分突破到環(huán)外，形成較大面積的菌落。(HA/CHI)5組的金黃色葡萄球菌也有部分突破到環(huán)外，形成較大面積的菌落，而由于萬(wàn)古霉素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有強(qiáng)烈的殺菌作用，(HA/CHI-Van)5組的細(xì)菌在玻璃片中間被殺死，不能突破到環(huán)外。掃描電鏡結(jié)果顯示分別與金黃色葡萄球菌接觸培養(yǎng)8 h后，在空白組硅片表面和(HA/CHI)5組硅片均可以觀察到大量形狀為圓形的活細(xì)菌，但是(HA/CHIVan)5組硅片表面細(xì)菌卻很少。見(jiàn)圖3。

圖2 活細(xì)菌染色的熒光顯微鏡圖像（×20）

圖3 金黃色葡萄球菌的越獄實(shí)驗(yàn)（a-c）和掃描電鏡結(jié)果（d-f，×4 000）

圖4 大鼠傷口觀察（a-c）及骨髓腔細(xì)菌檢查（d-e）

2.4 大鼠傷口觀察和骨髓腔細(xì)菌檢查 空白組傷口有黃白色的膿液溢出，表明細(xì)菌繁殖并且無(wú)法控制。(HA/CHI-Van)5組的傷口愈合良好，無(wú)化膿，無(wú)異常流液，與假手術(shù)組相似。擴(kuò)增骨髓液并在血平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，我們發(fā)現(xiàn)空白組中出現(xiàn)了大量細(xì)菌，而且單個(gè)菌落呈金黃色，大而凸，圓形且不透明，表面光滑，周?chē)腥苎h(huán)。這特異性證明傷口表面的細(xì)菌是金黃色葡萄球菌。但是在(HA/CHIVan)5組中，無(wú)法培養(yǎng)出細(xì)菌。假手術(shù)組未注射細(xì) 菌，因此未進(jìn)行細(xì)菌檢查。見(jiàn)圖4。

2.5 X線(xiàn)檢查和評(píng)分 從X線(xiàn)片檢查結(jié)果可以看出，空白組的脛骨平臺(tái)顯示不清，骨質(zhì)破壞嚴(yán)重，出現(xiàn)溶骨性病變。假手術(shù)組顯示出正常的骨形態(tài)， (HA/CHI-Van)5組未能發(fā)現(xiàn)骨病變情況。為了量化骨感染的程度，遵循骨感染放射學(xué)評(píng)估系統(tǒng)，計(jì)算后可以發(fā)現(xiàn)空白組的得分為12.30±0.86， (HA/CHI-Van)5組的得分為0.70±0.47，假手術(shù)組的得分為0.30±0.47。X線(xiàn)得分越低，說(shuō)明骨形態(tài)越好。(HA/CHI-Van)5組X線(xiàn)得分方面優(yōu)于空白組（P＜0.05），且非常接近假手術(shù)組（P＞0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 X線(xiàn)檢查結(jié)果

2.6 CT檢查 我們進(jìn)一步使用Micro-CT對(duì)植入6周后獲得的骨標(biāo)本進(jìn)行成像評(píng)估（見(jiàn)圖6d-f），并基于內(nèi)置軟件制作了3D圖（見(jiàn)圖6a-c）?？瞻捉M中的大鼠橋接和再生的速度最慢，圖中的黃色部分代表新骨骼，6周后僅形成少量新骨骼。同樣，這組骨小梁微結(jié)構(gòu)也最稀疏。假手術(shù)組新骨再生良好，并顯示出良好的骨小梁微結(jié)構(gòu)，(HA/CHI-Van)5組也表現(xiàn)良好。接著我們對(duì)各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析，空白組的BMD數(shù)值為（0.012±0.008）g/cm3，(HA/CHI-Van)5組為（0.047±0.004）g/cm3，假手術(shù)組為（0.058± 0.017）g/cm3?？瞻捉M的骨小梁數(shù)量為（1.238± 0.088）mm-1，(HA/CHI-Van)5組為（1.490±0.135）mm-1， 假手術(shù)組為（1.495±0.117）mm-1?？瞻捉M的骨體積分?jǐn)?shù)為（20.082±1.236）%，(HA/CHI-Van)5組為（31.188±2.216）%，假手術(shù)組為（31.955±4.513）%。(HA/CHI-Van)5組在BMD、骨小梁數(shù)量和骨體積分?jǐn)?shù)方面均優(yōu)于空白組（均P＜0.05），并且非常接近假手術(shù)組（均P＞0.05）。見(jiàn)圖6。

圖6 克氏針周?chē)鹿切纬汕闆r

2.7 骨組織HE染色 空白組的骨組織受到嚴(yán)重感染，形成膿腫，骨小梁形態(tài)消失，大多數(shù)骨髓細(xì)胞廣泛壞死，炎性細(xì)胞核染成黑色，并且炎性細(xì)胞廣泛分布。(HA/CHI-Van)5組和假手術(shù)組的骨組織結(jié)構(gòu)正常，炎癥細(xì)胞不明顯，骨小梁清晰可見(jiàn)。見(jiàn)圖7。

圖7 骨組織HE染色（×200）

3 討論

隨著社會(huì)的發(fā)展和交通運(yùn)輸?shù)脑黾?，由高能暴力（如?chē)禍和機(jī)械設(shè)備）引起的四肢骨折越來(lái)越多。臨床上，通常使用外固定或內(nèi)固定治療。外固定支架不易操作，患者佩戴不舒服，價(jià)格昂貴，更重要的是，它容易造成骨折畸形，使用骨內(nèi)植入物則沒(méi)有這種問(wèn)題。然而，內(nèi)植入物感染是骨科手術(shù)失敗的重要原因，這增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)并在嚴(yán)重情況下導(dǎo)致殘疾。盡管采取了預(yù)防植入物感染的措施，但仍有大約5%～10%的內(nèi)植入物患者被感染[2-5]。 在臨床治療中，盡管使用了延遲手術(shù)和長(zhǎng)期的抗生素治療，但古斯蒂洛-安德森（Gustilo-Anderson）III型骨折的感染率仍然很高，甚至達(dá)到52%，而且當(dāng)再次植入骨植入物時(shí)，這些殘留的細(xì)菌會(huì)在植入物的表面上繁殖，從而導(dǎo)致感染的復(fù)發(fā)[6]。

研究人員首先探討了植入物感染的原因。在內(nèi)部植入物材料的表面張力和靜電作用下，細(xì)菌黏附并在植入物表面繁殖[7]。附著在植入物表面的細(xì)菌開(kāi)始分泌細(xì)胞外基質(zhì)和分裂增生[8]。針對(duì)上述骨植入物感染的原因，研究人員在骨科抗菌涂層的改性方面取得了兩個(gè)方面的重大進(jìn)展：①植入物的表面裝有抑菌物質(zhì)涂層以抑制粘連植入物表面的細(xì)菌污染，也稱(chēng)為被動(dòng)抑菌；②在骨植入物的表面上修飾殺菌材料涂層，當(dāng)細(xì)菌與植入物的表面接觸時(shí)直接殺死細(xì)菌，這也稱(chēng)為主動(dòng)殺菌[9-11]。這為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了一個(gè)思路，可以制備出具有抗細(xì)菌黏附和殺菌功能的多層膜結(jié)構(gòu)。

層層自組裝技術(shù)于20世紀(jì)90年代初期被正式提出[12]。層層自組裝技術(shù)通過(guò)改變自組裝多層膜的層數(shù)和聚電解質(zhì)的類(lèi)型，可以容易地控制多層膜的物理和化學(xué)性質(zhì)。各種生物分子（如蛋白質(zhì)、酶、藥物和納米顆粒）可以一層一層地沉積而不會(huì)失去其生物學(xué)功能[13]。目前，它們已被用于調(diào)節(jié)細(xì)菌黏附，制造陽(yáng)離子涂料等，層層自組裝技術(shù)的應(yīng)用前景在醫(yī)用領(lǐng)域方面非常廣闊。骨科感染最常見(jiàn)的細(xì)菌是金黃色葡萄球菌[14]，萬(wàn)古霉素是一種糖肽抗菌劑，對(duì)侵襲性的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有很強(qiáng)的作用，被認(rèn)為是治療金黃色葡萄球菌的首選藥物。CHI是生物學(xué)上僅次于蛋白質(zhì)膠原的最重要的動(dòng)物結(jié)構(gòu)材料，其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，活性羥基和氨基形成具有高電子密度的線(xiàn)性聚電解質(zhì)鏈，使其表面帶正電并能夠吸引陰離子聚集體。CHI可以以1%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)溶于乙酸溶液中，它具有良好的生物相容性，沒(méi)有毒性和不良反應(yīng)，可以在體內(nèi)被生物降解[15-16]。研究表明，帶正電的CHI分子與帶負(fù)電的微生物細(xì)胞膜之間的相互作用導(dǎo)致細(xì)胞膜的破壞，最終有助于殺菌作用[16]。CHI由于其固有的抗菌特性已被用作預(yù)防感染的抗菌劑。然而，在骨組織工程中，單獨(dú)使用CHI作為骨移植材料并不罕見(jiàn)，主要是將CHI復(fù)合到其他材料中起特定作用，例如復(fù)合支架材料形式，載體形式，涂層形式等[17]。HA是一種線(xiàn)性大分子黏多糖，廣泛分布于人和動(dòng)物中，具有廣泛的臨床療效。例如，在關(guān)節(jié)疾病的治療中，可以添加HA以恢復(fù)滑液的潤(rùn)滑功能并促進(jìn)關(guān)節(jié)修復(fù)[18]。因此，該實(shí)驗(yàn)使用可靠的材料來(lái)制備多層膜，以避免不良反應(yīng)。

本研究通過(guò)層層自組裝方法制備(HA/CHI-Van)n多層膜結(jié)構(gòu)。首先，通過(guò)物理吸附技術(shù)使基材表面胺化，然后使用帶負(fù)電的HA和帶正電的CHI-Van之間的靜電相互作用來(lái)制備(HA/CHI-Van)n雜化涂層。由于HA溶液本身具有負(fù)電荷，CHI溶液具有正電荷，隨著組裝過(guò)程的進(jìn)行，每次應(yīng)用單層時(shí)，測(cè)得的電位正負(fù)交替變化，這表明通過(guò)靜電相互作用成功完成了聚合物層的組裝。而且該合成方法簡(jiǎn)便易行，可實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)。

本研究采用活細(xì)菌染色實(shí)驗(yàn)，證明在沒(méi)有抗生素的情況下，CHI對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有一定的抗黏附作用，這是因?yàn)镃HI可與細(xì)菌細(xì)胞膜發(fā)生相互反應(yīng)而導(dǎo)致細(xì)菌溶解死亡。越獄實(shí)驗(yàn)和FE-SEM實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)細(xì)菌濃度較大時(shí)，(HA/CHIVan)n多層膜結(jié)構(gòu)對(duì)金黃色葡萄球菌依然具有良好的殺菌作用。本研究還進(jìn)行了大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)(HA/CHI-Van)n多層膜的抗菌性能。X線(xiàn)影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，空白組脛骨平臺(tái)處出現(xiàn)骨質(zhì)溶解，出現(xiàn)嚴(yán)重的骨膜反應(yīng)。有意思的是，(HA/CHI-Van)n組的骨形態(tài)完好，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病變，而且非常接近假手術(shù)組。本研究又進(jìn)行了CT檢查。BMD是骨質(zhì)量的一個(gè)重要標(biāo)志，反映骨質(zhì)疏松程度，預(yù)測(cè)骨折危險(xiǎn)性的重要依據(jù)。骨小梁數(shù)量用于描述骨小梁結(jié)構(gòu)形態(tài)，解釋骨量變化，其變化可影響骨量，在寬度一定的條件下，數(shù)量越多，骨量越多。骨體積分?jǐn)?shù)表示骨組織體積與組織體積比值，可直接反映骨量多少。通過(guò)檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)(HA/CHI-Van)n組的上述數(shù)據(jù)均優(yōu)于空白組，而研究表明骨骼再生需要更嚴(yán)格的無(wú)菌條件，并且細(xì)菌定植會(huì)嚴(yán)重阻礙骨骼再生過(guò)程[19]，證明(HA/CHI-Van)n組具有良好的抗感染效果，而接近假手術(shù)組則說(shuō)明(HA/CHI-Van)n多層膜結(jié)構(gòu)具有良好的生物相容性。各組骨組織切片結(jié)果也符合上述規(guī)律。因此，該多層膜結(jié)構(gòu)兼有抗細(xì)菌黏附和殺菌的功能，同時(shí)具有良好的生物相容性，是一種很有潛力的預(yù)防骨植入物感染醫(yī)用材料。