洛哌丁胺體外對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的殺傷作用

陳 希，許智星，劉旭杰，田錦濤，牛小群，蒲 軍

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，云南昆明 650101；2）普洱市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，云南 普洱 665000）

膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）惡性腫瘤，雖然其基本不會(huì)轉(zhuǎn)移，但其生長(zhǎng)位置特殊，5 a 死亡率在所有人惡性腫瘤中位居惡性胰腺癌及原發(fā)性肺癌之后，排名第三[1]。由于膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展的原因、調(diào)控基因及其發(fā)病通路有待探索明確，膠質(zhì)瘤的藥物治療一直進(jìn)展緩慢。目前我國(guó)對(duì)膠質(zhì)瘤的藥物治療主要是以替莫唑胺（temozolomide，TMZ）為基礎(chǔ)的藥物化療[2-3]，一旦替莫唑胺出現(xiàn)耐藥，患者將直接面對(duì)死亡的風(fēng)險(xiǎn)和威脅。但新藥的開(kāi)發(fā)和研制往往面臨著藥物研發(fā)難度大、醫(yī)療費(fèi)用和成本高、國(guó)家衛(wèi)生部門(mén)審批慢等諸多復(fù)雜問(wèn)題[4]。因此，為節(jié)省基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高臨床實(shí)驗(yàn)效率及臨床醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化和實(shí)用性，筆者直接對(duì)已開(kāi)發(fā)并上市的藥物進(jìn)行抗腫瘤篩選。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，筆者發(fā)現(xiàn)已上市的腹瀉用藥洛哌丁胺具有一定的抗GSCs 作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與主要試劑

膠質(zhì)瘤干細(xì)胞3#（中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所趙旭東團(tuán)隊(duì)提供），人小腦膠質(zhì)細(xì)胞HAC（中國(guó)科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所提供）、鹽酸洛哌丁胺，分子式：C29H33O2NCl，2 mg/粒（西安，Janssen，美國(guó)），溶劑DMSO（Sigma，美國(guó)），B-27 Supplement（50X）（Gibco，美國(guó)），小鼠神經(jīng)元層粘連蛋白laminin （Gibco，美 國(guó)），TrypLETMEpress 酶（1X）（Gibco，美 國(guó)），bFGF （Peprotech，美 國(guó)），EGF（Peprotech，美國(guó)），F(xiàn)BS（Gibco，美國(guó)），雙抗（100 X）P/S（碧云天，中國(guó)），Trypsin（Gibco，美國(guó)），Phosphate緩沖液（BI，以色列），MTS比色試劑盒（Promega，美國(guó)），液體DMEM/F-12（Gibco，美國(guó)），EDU（綠色）試劑盒（Polysciences，美國(guó)），4%PFA（BI，以色列），Triton X-100（國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)），BSA（MP Biomedicals，美國(guó)），Dapi 4'，6-diamidino-2-phenylindole（Sigma，美國(guó)），液體DMEM basic（BI，以色列），Annexin V-FITC（Sigma，美國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的培養(yǎng) 以1：150 的比例用PBS 稀釋laminin 后以2.5 mL/6cm 皿的比例鋪板，4～8 h 后吸出PBS，將長(zhǎng)至3/4 左右密度的GSC 3#細(xì)胞用TrypLETMEpress（1X）消化后用4～5 倍體積DMEM/F-12 basic 終止消化；離心收GSC 3#，用干細(xì)胞培養(yǎng)液（B27，細(xì)胞因子bFGF 與EGF，DMEM/F-12 basic，1×P/S）重懸細(xì)胞后傳入鋪有l(wèi)aminin 的6 cm 皿中，待細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)予以實(shí)驗(yàn)（48～72 h 后）。正常人小腦膠質(zhì)細(xì)胞，無(wú)需鋪laminin，0.25%Trypsin 消化后，使用常規(guī)培養(yǎng)基（DMEMbasic，1%P/S，10%FBS）培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞活力測(cè)定 打開(kāi)洛哌丁胺膠囊，用DMSO 將洛哌丁胺稀釋為濃度5 μg/mL 的液體，離心機(jī)5 000 r/min 離心5 min 去除淀粉等輔料。在96 孔板中以同樣的方法鋪laminin 50 μL/孔，12 孔一組，重復(fù)做兩組，4～8 h 后計(jì)數(shù)并傳入GSC 3#細(xì)胞20 000 個(gè)；用同樣的方法，將正常人小腦膠質(zhì)細(xì)胞HAC 以20 000 個(gè)/孔鋪入96 孔板中，96孔板邊緣孔均用PBS 液封。細(xì)胞傳入96 孔24 h后，洛哌丁胺以80 μg/mL，40 μg/mL，20 μg/mL，10 μg/mL……0.039 μg/mL 的濃度梯度稀釋?zhuān)⒓尤?6 孔板中。72 h 后吸走孔中上清，以DMEM/F-12：MTS 或DMEM：MTS=9:1 的比例稀釋并加入MTS，待MTS 與細(xì)胞線(xiàn)粒體多種脫氫酶反應(yīng)形成甲瓚化合物并變色后，上酶標(biāo)儀檢測(cè)。該過(guò)程GSC 3# 細(xì)胞需要4～6 h，HAC 需要20～30 min，以490 nm 吸光值測(cè)量洛哌丁胺殺傷后細(xì)胞的生存能力。

1.2.3 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)前1 d，在24 孔板中鋪laminin，4～8 h 后傳入80 000 個(gè)GSC 3#細(xì)胞，正常組和對(duì)照組各做3 個(gè)副孔；24 h 后以10 μg/mL 的濃度加入洛哌丁胺，12 h 后觀察3#細(xì)胞變圓，此時(shí)加入EDU 孵育1 h，孵育完成后分別使用4%PFA 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、3%BSA 清洗、試劑盒染熒光、DAPI 對(duì)視野內(nèi)所有細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，在顯微鏡觀察、拍照并計(jì)數(shù)分析。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 以1.2.3 中方法鋪GSC 3#細(xì)胞并按照10 μg/mL 濃度加入洛哌丁胺，16 h 后，用TrypLETMEpress 快速消化下細(xì)胞，4～5 倍體積DMEM/F-12 basic 終止胰酶消化作用后1 200 r/min，4 min 離心收細(xì)胞，離心后快速使用1:9 稀釋的緩沖Buffer（1 X）重懸。重懸完全后以2:1 的比例加入Annexin V 與PI 進(jìn)行凋亡染色，開(kāi)空調(diào)測(cè)量室內(nèi)溫度為25℃時(shí)予以孵育10 min，再按照空白組、早期調(diào)零組、中晚期調(diào)零組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的順序依次通過(guò)流式細(xì)胞儀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5.0 處理IC50（half maximal inhibitory concentration）數(shù)據(jù)；使用FlowJo 10 進(jìn)行GSCs 凋亡分析；數(shù)據(jù)通過(guò)使用SPSS 17.0軟件分析；實(shí)驗(yàn)結(jié)果用LSD-t檢驗(yàn)對(duì)各結(jié)果進(jìn)行比較，當(dāng)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 洛哌丁胺對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞3#的殺傷作用

通過(guò)評(píng)估洛哌丁胺對(duì)GSC 3# 的殺傷作用IC50=9.887 μg/mL；對(duì)正常小腦膠質(zhì)細(xì)胞HAC 的殺傷作用（副作用）IC50=40.71 μg/mL，發(fā)現(xiàn)洛哌丁胺對(duì)于GSC-33 的殺傷具有一定的選擇性。且其殺傷能力相比較膠質(zhì)瘤化療用藥替莫唑胺（IC50 ＞23.30 mg/mL）[5]，具有明顯的優(yōu)越性（圖1、圖2）。

圖1 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)觀察洛哌丁胺處理后GSC 3#的生存能力變化，濃度為20 μg/mL(40×物鏡)Fig.1 The cytotoxic test：Morphology of loperamide treatment on GSC 3# viability at 20 μg/mL (magnification,40×)

圖2 洛哌丁胺對(duì)GSC3#和HAC 的半數(shù)抑制率Fig.2 The cytotoxicity test,cell viability and IC50 value for GSCs and HAC

2.2 洛哌丁胺對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖能力的影響

在上一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)洛派丁胺可在一定濃度范圍內(nèi)識(shí)別并殺傷GSC 3#，但其機(jī)制并不清楚。通過(guò)測(cè)定GSC 3# 對(duì)照組及洛哌丁胺殺傷組（10 μg/mL，16 h）的免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，加藥組EDU 陽(yáng)性細(xì)胞的比例明顯減少（**P＜0.001）。由此可以得出結(jié)論，即洛哌丁胺通過(guò)抑制GSC 3#DNA 合成，抑制細(xì)胞的增殖（圖3）。

圖3 洛哌丁胺抑制GSC 3#的增殖Fig.3 Loperamidesuppressed GSC 3# proliferation

2.3 洛哌丁胺促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡

將GSC 3# 分別用濃度為15 μg/mL（IC80 濃度）的洛哌丁胺與溶劑DMSO 處理16 h。然后使用Annexin V-FITC 流式凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)DMSO處理組和洛哌丁胺處理組細(xì)胞分別進(jìn)行凋亡測(cè)定。數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)洛哌丁胺處理后，相比于對(duì)照組3%左右的凋亡率,洛哌丁胺組GSC 3#的凋亡率顯著提升至15%以上（P＜0.01），說(shuō)明洛哌丁胺通過(guò)凋亡途徑誘導(dǎo)GSCs 的死亡（圖4）。

圖4 洛哌丁胺誘導(dǎo)GSC 3#的凋亡Fig.4 A.Loperamide induces GSC 3 # apoptosis.

3 討論

膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（GSCs）是一組具有極強(qiáng)的持續(xù)無(wú)限的增殖能力和持續(xù)自我更新（self-renewal）能力的細(xì)胞，不僅如此，GSCs 還可能是膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)、侵襲及耐藥的源頭[6-7]，因此，針對(duì)GSCs 的藥物治療，被認(rèn)為是一種潛在的膠質(zhì)瘤治療途徑[8-10]。目前，在國(guó)內(nèi)外經(jīng)典的膠質(zhì)瘤治療指南中，化療藥物是其必不可少的一環(huán)，但目前國(guó)內(nèi)的膠質(zhì)瘤化療藥物品種單一，國(guó)內(nèi)膠質(zhì)瘤化療方案基本都是基于DNA 烷基化代表藥物替莫唑胺（TMZ）[5，11-12]。且目前有許多研究結(jié)果表明，替莫唑胺對(duì)于處于靜止期的部分膠質(zhì)瘤干細(xì)胞群體，殺傷效果較差[12-14]。

在腫瘤的相關(guān)治療中，洛哌丁胺通常用于治療化療后的胃腸道反應(yīng)[15]，有文獻(xiàn)顯示，洛哌丁胺能有效逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的MCF-7/MDR1 人乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抵抗[16]，但尚無(wú)直接殺傷腫瘤細(xì)胞的報(bào)道。在本次實(shí)驗(yàn)研究中，筆者發(fā)現(xiàn)止瀉藥洛哌丁胺不僅能抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖，并通過(guò)凋亡途徑，誘導(dǎo)GSC 3#死亡，這表明洛哌丁胺具有成為膠質(zhì)瘤化療藥物的潛力。而且作為已上市藥物，其相比較新藥所需的繁瑣審批及長(zhǎng)周期臨床實(shí)驗(yàn)而言，具有方便易得、治療成本低等特點(diǎn)。

但本次實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)還有不足之處，如本次實(shí)驗(yàn)僅局限于體外GSCs，洛哌丁胺在體內(nèi)的殺傷效果及對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胃腸道反應(yīng)的的影響等未予探究；藥物中的輔料如淀粉等，在配藥過(guò)程中存在潮解現(xiàn)象，對(duì)藥物形成了輕微的稀釋?zhuān)槐敬螌?shí)驗(yàn)僅使用了一個(gè)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞即3#細(xì)胞系；洛哌丁胺導(dǎo)致膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制也尚待發(fā)掘。這些問(wèn)題有待進(jìn)一步研究。