纖維板霉變微生物的分離鑒定及生長抑制方法

樊壬水，何賢蓉，葉偉，蔡政良，胡松青

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640)

隨著我國人造板工業(yè)的不斷發(fā)展，人造纖維板在家具和裝修市場上的應(yīng)用日益頻繁，根據(jù)《中國人造板產(chǎn)業(yè)報(bào)告(2018)》[1]數(shù)據(jù)顯示，2017年全國纖維板產(chǎn)品消費(fèi)量約6 370萬m3。由于現(xiàn)有纖維板制造工藝以及我國南方梅雨天氣溫濕度的影響，導(dǎo)致南方地區(qū)纖維板較易發(fā)生霉變。霉變后的纖維板不僅影響產(chǎn)品外觀，并且嚴(yán)重危害到使用者的健康。在纖維板制作和使用過程中利用防霉抗菌劑進(jìn)行防護(hù)處理，可以達(dá)到防霉的效果，提高纖維板的應(yīng)用價(jià)值[2]。劉媛等[3]利用化學(xué)復(fù)配防霉劑浸泡處理中密度纖維板，發(fā)現(xiàn)防霉效果良好。

自然界中存在許多能夠降解木質(zhì)纖維素的微生物，目前已分離出200余種[4]。真菌是降解木質(zhì)纖維素的主要微生物，已報(bào)道的真菌包括曲霉(Aspergillussp.)[5]、木霉(Trichodermasp.)[6]和瘤胃真菌(Neocallimastixfrontalis)[7]等，這些真菌都有可能導(dǎo)致纖維板發(fā)生霉變。國家建材行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)JC/T 2039—2010《抗菌防霉木質(zhì)裝飾板》中規(guī)定以黑曲霉(A.niger)、土曲霉(A.terreus)、宛氏擬青霉(Paecilomycesvarioti)、繩狀青霉(P.funicolosum)、出芽短梗霉(A.pullulans)和球毛殼(Chaetoomiumglobsum)等7個(gè)菌種作為木質(zhì)裝飾板霉變檢測菌種。有針對性的菌種選擇是進(jìn)行木材防霉劑研制的關(guān)鍵，黃曉東等[8]研究淀粉酶處理對竹材防霉性能的影響時(shí)，選用黑曲霉、桔青霉(P.citrinum)和綠色木霉(T.viride)作為供試菌種；許士玉等[9]研究制備抗菌防霉腐纖維板時(shí)，以白腐菌(Phlebia)、黑曲霉和褐腐菌(Monilinia)作為供試菌種。然而迄今為止，關(guān)于纖維板霉變微生物分離鑒定的研究則相對較少，宋賢沖等[10]研究發(fā)現(xiàn)廣西南寧纖維板霉變微生物主要是木霉屬和脈孢霉屬(Neurosporasp.)真菌，其中木霉屬真菌為優(yōu)勢種群。進(jìn)一步分離鑒定致纖維板霉變微生物，發(fā)現(xiàn)更多的致霉變菌株，對提升纖維板的科學(xué)防霉水平具有重要意義。

筆者利用傳統(tǒng)真菌形態(tài)學(xué)觀察、核糖體DNA-內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)序列分析和同源性比較相結(jié)合的方法，對南方嬰幼兒床具纖維板霉變微生物進(jìn)行了分離鑒定，并分析了霉變微生物的基本生理特性，探究了碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC)和紫外線輻照處理對霉菌生長的抑制作用，旨在為纖維板霉變的防治工作提供理論依據(jù)和建議，提高纖維板產(chǎn)品質(zhì)量，減少產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

表面霉變纖維板：廣東省某企業(yè)嬰幼兒床上用具產(chǎn)品中所使用的中密度纖維板(木質(zhì)纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%～85%、膠黏劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%～15%、石蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%～2.0%、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.5%～7.0%)，質(zhì)量符合中密度纖維板國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 11718—2009《中密度纖維板標(biāo)準(zhǔn)》)。PfuMax HiFi PCR ProMix購自廣州英贊生物科技有限公司；微生物直接PCR用裂解液購自天根生化科技(北京)有限公司；IPBC試劑(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%)購自廣州艾浩爾防霉抗菌科技有限公司。

馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L。高鹽察式固體培養(yǎng)基：硝酸鈉2 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、氯化鈉60 g、蔗糖30 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L。上述培養(yǎng)基于121 ℃條件下滅菌20 min，用于分離鑒定霉菌微生物。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Cx31-32CO2型生物顯微鏡，日本OLYMPUS有限公司；HJ-1406型紫外燈，廣東雪萊特光電科技股份有限公司；EDC-80型PCR基因擴(kuò)增儀，東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；LRH-250-HS型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 微生物樣本采集

用浸有滅菌生理鹽水的無菌棉簽在霉變纖維板表面反復(fù)涂抹多次，剪去與手接觸部分的棉棒，將棉簽放入含10 mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)，立即用于后續(xù)的分離純化培養(yǎng)，在不同霉變部位共采集樣本30份。

1.3.2 纖維板霉變微生物分離純化和保存

利用稀釋平板法進(jìn)行菌株的分離培養(yǎng)，將采集的樣品用滅菌水進(jìn)行梯度稀釋，取適量稀釋液分別涂布于PDA固體培養(yǎng)基和高鹽察式固體培養(yǎng)基的平板表面，于28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d；利用三區(qū)劃線法進(jìn)行菌株的純化培養(yǎng)，挑取單個(gè)優(yōu)勢菌落的菌絲，重懸于滅菌水中，取適量重懸液進(jìn)行三區(qū)劃線，于28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d；用斜面法進(jìn)行分離菌株的保存。

1.3.3 纖維板霉變微生物的形態(tài)學(xué)分析

對分離純化得到的單菌落，參考《真菌鑒定手冊》[11]進(jìn)行菌落特征分析，對菌落的大小、顏色、形狀等性狀進(jìn)行觀察。在無菌操作臺(tái)內(nèi)挑取少量菌絲制成玻片，于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行個(gè)體形態(tài)特征分析，根據(jù)文獻(xiàn)[12]和食品微生物學(xué)檢驗(yàn)國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 4789.16—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)常見產(chǎn)毒霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定》)做出初步鑒定。

1.3.4 纖維板霉變微生物rDNA-ITS序列分析和同源性比對

1)待測菌的裂解和rDNA-ITS序列的PCR擴(kuò)增。參考Vioti等[13]的實(shí)驗(yàn)方法，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增ITS序列的實(shí)驗(yàn)，具體步驟如下：收集培養(yǎng)3～5 d的新鮮菌絲，置于微生物直接PCR用裂解液中80 ℃裂解菌絲30 min，離心取上清于-20 ℃保存。采用真菌ITS通用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′- T￣C￣C￣T￣C￣C￣G￣C￣T￣T￣A￣T￣T￣G￣A￣T￣A￣T￣G￣C-3′)[13]進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，引物由廣州艾基生物有限公司合成。反應(yīng)體系為：2×Pfu Max HiFi PCR ProMix 25 μL，引物對各1 μL，DNA模板50～500 ng，補(bǔ)滅菌超純水至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后68 ℃延伸5 min。反應(yīng)液經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，切膠使用膠回收試劑盒純化回收擴(kuò)增片段，回收得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至廣州艾基生物有限公司進(jìn)行測序分析。

2)rDNA-ITS序列同源性比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。將測序結(jié)果輸入美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)核酸序列數(shù)據(jù)庫中，使用基本的局部比對搜索工具(BLAST)進(jìn)行分析，依據(jù)比對結(jié)果判斷菌株所屬種，當(dāng)待測序列與數(shù)據(jù)庫中參照序列的同源性大于或等于99%時(shí)，則可視為同一種屬。查找每種菌種相關(guān)的代表菌種的rDNA-ITS基因序列，使用MEGAX軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[14]。系統(tǒng)進(jìn)化樹采用鄰接法進(jìn)行構(gòu)建，運(yùn)算1 000次，計(jì)算進(jìn)化距離，通過Bootstrap軟件對運(yùn)算結(jié)果進(jìn)行評價(jià)。

1.3.5 IPBC和紫外線處理對霉菌生長的影響

IPBC試劑用滅菌超純水分別稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%，0.15%和0.30%，無菌條件下取10種霉菌適量的菌絲懸浮液40 μL分別和不同稀釋濃度的IPBC試劑或滅菌水20 μL混合，再將60 μL混合液涂布于PDA固體培養(yǎng)基或高鹽察式固體培養(yǎng)基平板表面。由于固體培養(yǎng)基上存在凝結(jié)水，因此，IPBC實(shí)際工作濃度會(huì)遠(yuǎn)小于處理濃度，不會(huì)超過IPBC的安全使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.10%)[15]。在28 ℃ 下倒置培養(yǎng)5 d，對照組涂布菌液不添加IPBC試劑。

紫外線輻照處理試驗(yàn)方法：無菌條件下取10種霉菌適量的菌絲懸浮液，涂布于PDA固體培養(yǎng)基或高鹽察式固體培養(yǎng)基平板表面，于紫外燈(功率38 W，波長253.7 nm)下分別照射10，15和30 min后，在28 ℃下倒置培養(yǎng)5 d，對照組不經(jīng)紫外燈照射處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維板霉變微生物形態(tài)學(xué)分析

經(jīng)稀釋平板法和三區(qū)劃線法多次分離純化，培養(yǎng)得到10株形態(tài)不同的霉變菌株(標(biāo)記為菌1～10)，對10株霉變菌株的菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)描述及初步鑒定結(jié)果如表1所示，其菌落形態(tài)如圖1a所示，顯微鏡個(gè)體形態(tài)如圖1b所示。通過菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)的分析，初步鑒定10株霉變菌株中，菌1、菌4、菌5、菌6、菌7和菌8為曲霉屬霉菌，菌3為青霉屬霉菌，菌9和菌10為短梗霉屬霉菌[16]，菌2無法確定。

表1 霉變菌株菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)描述Table 1 Morphology and microscopic description of moldy microbial strains

表1(續(xù))

a. 菌落形態(tài); b. 個(gè)體形態(tài)(×400)。圖1 霉變菌株菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)特征Fig. 1 Colony morphological and microscopic characteristics of moldy microbial strains

2.2 纖維板霉變微生物rDNA-ITS序列分析鑒定

ITS序列包括ITS1和ITS2兩個(gè)部分，由于其進(jìn)化相對迅速且具有多態(tài)性，因而常被用于真菌的分子生物學(xué)鑒定[17]。用于真菌鑒定的ITS序列通常包括ITS1、5.8 S和ITS2，真菌ITS區(qū)域長度一般在500～750 bp。實(shí)驗(yàn)共鑒定了10株菌株，ITS區(qū)域經(jīng)過PCR擴(kuò)增后片段均在500～700 bp，結(jié)果符合預(yù)期。將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析比對，然后選取同源性最高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹[因版面限制，具體參見開放科學(xué)計(jì)劃(OSID)附圖1]。根據(jù)BLAST分析以及進(jìn)化樹分支鑒定菌株，結(jié)果如表2所示。10株菌株中曲霉屬共6株，占總數(shù)的60%，其中1號(hào)、5號(hào)、7號(hào)菌株，雖都屬于帚狀曲霉，但它們的ITS序列不完全一致；菌株3屬于青霉屬的簡青霉；菌株4為假灰綠曲霉；菌株6為謝瓦氏曲霉；菌株8為阿姆斯特丹曲霉；菌株9與菌株10號(hào)均為短梗霉屬的產(chǎn)黑色素短梗霉；比較特殊的是菌株2經(jīng)分子鑒定為爪甲團(tuán)囊菌目的Sigleriacarmichaelii，2015年國外學(xué)者Hirooka首次在家居灰塵中發(fā)現(xiàn)[18]，目前國內(nèi)暫未對Sigleriacarmichaelii進(jìn)行具體的種屬分類和中文名命名，后續(xù)可以對其進(jìn)行下一步研究，以期完善爪甲團(tuán)囊菌目的真菌分類。rDNA-ITS序列測定結(jié)果和形態(tài)學(xué)分析結(jié)果相一致，綜上可知，引起南方嬰幼兒床具纖維板霉變的微生物主要為曲霉屬的霉菌，且本研究中鑒定出的產(chǎn)黑色素短梗霉和Sigleriacarmichaelii是新發(fā)現(xiàn)的致纖維板霉變的微生物。

表2 霉變微生物的rDNA-ITS序列分析結(jié)果Table 2 rDNA-ITS sequence analysis results of moldy microorganisms

在美國菌種保藏中心(ATCC)查找上述7種不同種屬霉菌的基本生理特性，匯總于表3。由表3可知，7株不同霉菌均為耐旱型的干性霉菌，適宜生長溫度均為25 ℃左右，這和纖維板表面相對干燥的環(huán)境是相符的。干性霉菌可在物品水分活度為0.65以上的環(huán)境中生長，為了更好地防止纖維板在使用過程中因吸水而發(fā)生霉變，可以使用塑封膜將其進(jìn)行塑封，同時(shí)盡可能降低纖維板制品儲(chǔ)存時(shí)的倉庫空氣濕度，保持通風(fēng)干燥的倉儲(chǔ)環(huán)境。

表3 霉變微生物的基本生理特性Table 3 Basic physiological characteristics of moldy microorganisms

2.3 IPBC和紫外線輻照處理對霉菌生長的抑制作用

IPBC是市售常用廣譜性真菌生長抑制劑的主要成分，具有低毒性和極低的過敏性[19]。不同質(zhì)量濃度的IPBC對霉菌生長的抑制作用如圖2所示，對照組霉菌生長旺盛，IPBC處理組均沒有霉菌的生長(即使是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%的IPBC處理組)，由此說明IPBC對纖維板霉變微生物的生長具有非常好的抑制作用。因此，在安全劑量范圍內(nèi)，合理利用IPBC處理操作臺(tái)面、原料或制品本身可達(dá)到防止纖維板霉變的目的。

a. 對照組; b、c、d. 分別為添加0.10%，0.15%和 0.30%的IPBC處理組。圖2 不同稀釋濃度的IPBC試劑對霉菌生長的抑制作用Fig. 2 Inhibitory effects of mold growth by different concentrations of IPBC reagent

為了避免IPBC等化學(xué)物質(zhì)的使用，筆者進(jìn)一步探討了紫外輻照對致纖維板霉變微生物的影響。紫外線輻照是常用的滅菌技術(shù)，對細(xì)菌和真菌的生長均具有抑制作用，具有廣譜性和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。紫外線輻照不同時(shí)間對霉菌生長的抑制作用如圖3所示，當(dāng)輻照時(shí)間為10 min時(shí)，霉菌有少量成長；延長至15 min時(shí)，只有個(gè)別霉菌的生長；當(dāng)輻照時(shí)間為30 min時(shí)，則無霉菌生長，由此說明紫外線輻照對纖維板霉變微生物的生長具有良好的抑制作用。因此，在使用纖維板制品時(shí)，可以合理地選擇紫外線輻照定期對生產(chǎn)環(huán)境和制品表面進(jìn)行殺菌處理，從而更好地防止纖維板制品發(fā)生霉變。

a. 對照組; b、c、d.分別為紫外線輻照10， 15和30 min的處理組圖3 紫外線輻照不同時(shí)間對霉菌生長的抑制作用Fig. 3 Inhibitory effects of mold growth by ultraviolet radiation at different time durations

3 結(jié) 論

筆者利用稀釋平板法和三區(qū)劃線法，從南方嬰幼兒床具霉變纖維板中分離純化得到了10株霉菌，利用傳統(tǒng)真菌形態(tài)學(xué)觀察和rDNA-ITS序列分析相結(jié)合的方法，對其加以鑒定，結(jié)論如下：

1)將分離所得的10株霉菌共確定為7個(gè)種，分別為帚狀曲霉、簡青霉、假灰綠曲霉、謝瓦氏曲霉、阿姆斯特丹曲霉、產(chǎn)黑色素短梗霉和爪甲團(tuán)囊菌目的Sigleriacarmichaelii，其中曲霉屬真菌為霉變優(yōu)勢種群，且產(chǎn)黑色素短梗霉和Sigleriacarmichaelii是新發(fā)現(xiàn)的致纖維板霉變的微生物。鑒定結(jié)果和宋賢沖等[10]在廣西南寧霉變纖維板中鑒定發(fā)現(xiàn)的霉變微生物有所不同，可見不同地區(qū)和不同倉儲(chǔ)環(huán)境下的纖維板，霉變微生物的種類存在較大的差異。

2)抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IPBC和紫外線輻照處理對纖維板霉變微生物生長有良好的抑制作用。研究結(jié)果不但豐富了纖維板霉變微生物的種類，還可為纖維板產(chǎn)品霉變防控和防霉劑研發(fā)等提供參考依據(jù)。