不同產(chǎn)地丹參質(zhì)量評價及指紋圖譜研究

高宇明，謝艷，張亞琴，何 琴，查 琪，陳興福，吳秀清*

(1.資陽市食品藥品檢驗檢測中心，四川 資陽 641300；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川 成都 611130)

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效，用于胸痹心痛、脘腹協(xié)痛、熱痹疼痛、心煩不眠、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)經(jīng)閉、瘡瘍腫痛等[1]。丹參富含多種有效成分，如丹參酮類、丹酚酸類等。近年來的研究表明，丹參及其有效成分有抗腫瘤、抗血栓、抗炎、護肝等作用[2]。

目前，以丹參為原料的中成藥有100余種，丹參年需求量巨大，在四川、山東、陜西、河南、安徽等地均有廣泛種植[3]。由于各地丹參種質(zhì)不一，栽培管理方式不同，各地氣候、土壤、環(huán)境、光照差異，導(dǎo)致各地所產(chǎn)丹參質(zhì)量參差不齊[4]。關(guān)于各地丹參品質(zhì)的研究已有一些報道[5]，對丹參的質(zhì)量評價研究也多集中在丹參酮類、丹酚酸類含量測定[6]，以及“一測多評”方法開發(fā)[7-8]等方面。本研究收集全國主要丹參產(chǎn)地的栽培丹參樣品，分析其浸出物、丹參酮類、丹酚酸B的含量，建立指紋圖譜，進行系統(tǒng)聚類分析，以評價不同產(chǎn)地丹參的質(zhì)量，為保證丹參藥材質(zhì)量穩(wěn)定提供技術(shù)依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT液相色譜儀(配SPD-20A檢測器)，MS205DU電子天平(梅特勒托利多)，HY-8型搖床(蘇州威爾實驗用品公司)，DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司)，TGL-16M型離心機(長沙維爾康湘鷹離心機有限公司)，KQ-700DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 試劑

丹酚酸B對照品(中國食品藥品檢定研究院111562-201716)，丹參酮IIA對照品(中國食品藥品檢定研究院110766-201721)，隱丹參酮對照品(中國食品藥品檢定研究院110852-201807)，丹參素鈉(中國食品藥品檢定研究院110855-201614)、迷迭香酸(中國食品藥品檢定研究院111871-201706)純度均大于98%。甲醇和乙腈為色譜純(Fisher公司)，水為注射用水，其他為分析純。

1.3 藥材

在不同產(chǎn)地收集的栽培丹參樣品，由資陽市食品藥品檢驗檢測中心吳秀清主任中藥師鑒定為丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)，具體信息見表1。

表1 不同產(chǎn)地丹參藥材基本信息

2 樣品測定方法及結(jié)果

2.1 水分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、丹參酮類、丹酚酸B含量測定

2.1.1 測定方法 參照《中國藥典》(2015年版)四部通則0832項下第二法測定各樣品的水分[9]；參照《中國藥典》(2015年版)四部通則2201項下的水溶性浸出物測定法冷浸法測定各樣品的水溶性浸出物含量；參照《中國藥典》(2015年版)四部通則2201項下的醇溶性浸出物測定法熱浸法以乙醇為溶劑測定醇溶性浸出物含量[10]。參照《中國藥典》(2015年版)一部中丹參含量測定項下測定法測定丹參酮類(隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA三者之和)和丹酚酸B的含量[1]。

2.1.2 結(jié)果與分析 《中國藥典》(2015年版)規(guī)定丹參藥材水分不得過13.0%，水溶性浸出物不得少于35.0%，醇溶性浸出物不得少于15.0%，隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA的總量不得少于0.25%，丹酚酸B不得少于3.0%[1]。由表2可知，5省產(chǎn)地的35個丹參藥材水分均符合規(guī)定。浸出物和含量測定結(jié)果差異較大，水溶性浸出物含量范圍為43.6%～65.6%，醇溶性浸出物含量范圍為14.6%～44.8%，丹參酮類含量范圍為0.180%～1.46%，丹酚酸B含量范圍為3.11%～8.31%。除山東莒縣庫山鎮(zhèn)1批樣品丹參酮類含量未達標(biāo)外，其他樣品均達到藥典標(biāo)準(zhǔn)；水溶性浸出物含量整體偏高，最低者43.6%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過藥典要求的35.0%。從各產(chǎn)地平均值看，四川產(chǎn)丹參水溶性浸出物含量最高(64.2%)，但醇溶性浸出物含量最低(15.2%)；河南產(chǎn)丹參醇溶性浸出物含量最高(22.2%)。丹參酮類含量以山東莒縣最高，達1.46%，是藥典標(biāo)準(zhǔn)的6倍；另外，山東沂水、山東諸城、陜西洛南、四川雁江丹參丹參酮類含量也較高，在1.0%及以上；從平均值看，四川最高(0.985%)，安徽最低(0.562%)。丹酚酸B含量以河南孟州最高，達8.11%；陜西洛南、河南盧氏、安徽亳州、山東莒縣、山東五蓮含量較低，在4.0%以下；從丹酚酸B含量平均值看，四川最高(6.96%)，山東最低(5.17%)。

表2 35批丹參藥材水分、浸出物、指標(biāo)成分含量結(jié)果

2.2 指紋圖譜

2.2.1 檢測方法 指紋圖譜檢測參考香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)中丹參項下高效液相指紋圖譜鑒別方法[11]。取丹參素、丹酚酸B、迷迭香酸、隱丹參酮、丹參酮IIA對照品適量，精密稱定，加合適溶劑制成每1 mL含20 μg的溶液，作為對照品溶液。

取丹參粉末0.2 g，置50 mL離心管中，加入甲醇10 mL，超聲處理30 min，離心5 min(1 200 r/min)，取上清液移入25 mL量瓶中，用水10 mL在50 mL燒杯中洗滌殘渣，稱定重量，用表面皿覆蓋燒杯，加熱至約90 ℃，浸提30 min，放冷，再稱重，必要時用水補足減失的重量，濾過提取液，至同一量瓶中，加甲醇至刻度，于4 ℃左右放置過夜，用0.2 μm濾膜過濾后靜置至室溫，作為供試品溶液。

色譜條件：選用XselectR Hss T3 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，乙腈-(水∶乙腈∶甲酸=90∶1∶0.4)為流動相，梯度洗脫(0～40 min，0%～30%；40～50 min，30%～80%；50～70 min，80%～85%)；流速1.0 mL·min-1，檢測波長280 nm，柱溫：30 ℃，進樣量10 μL。

2.2.2 不同產(chǎn)地丹參指紋圖譜對照圖譜生成及共有峰的指認(rèn) 取“2.2.1”項下供試品溶液注入液相色譜儀分析，記錄HPLC圖譜，通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.130723版本)》軟件分析，對照圖譜生成方法為“中位數(shù)”法，通過多點校正法對色譜峰進行全譜峰匹配，以S1為參照圖譜，分析得到35批丹參樣品的對照指紋圖譜R，共得到13個共有峰(見圖1)，通過對照品(見圖2)指認(rèn)了其中5個共有峰，分別為丹參素鈉(1號峰)、迷迭香酸(3號峰)、丹酚酸B(5號峰)、隱丹參酮(10號峰)、丹參酮IIA(13號峰)。其中5號峰峰面積較大，峰形較好，選擇作為參照峰，計算各共有峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表3。

圖1 丹參HPLC對照指紋圖譜

注：1.丹參素鈉；3.迷迭香酸；5.丹酚酸B；10.隱丹參酮；13丹參酮IIA

表3 35批丹參指紋圖譜共有峰相對峰面積

2.3 35批丹參共有峰情況分析

從表4和表5可以看出，13個共有峰中峰面積RSD在27.0%～64.3%之間，指認(rèn)出的5個共有峰中，5號峰丹酚酸B含量最高，峰面積RSD為27.4%，說明35批丹參中丹酚酸B含量較穩(wěn)定。其他共有峰中，RSD大于50%者有6個，表明各產(chǎn)地樣品的共有成分含量差異較大。

表4 35批丹參指紋圖譜共有峰峰面積RSD

2.4 35批丹參相似度評價

利用軟件計算樣品圖譜與對照圖譜的相似性，結(jié)果見表5。從分析結(jié)果可以看出，來自5個省的35批丹參藥材的相似度較高，相似度均在0.97以上，說明丹參的質(zhì)量比較穩(wěn)定，各地丹參成分差異不大。比較各樣品的相似度，在0.99以下的有3批，2批為河南盧氏縣產(chǎn)、1批為山東莒縣產(chǎn)，說明該3批丹參較其他丹參者有一定特殊性。結(jié)合產(chǎn)地調(diào)研情況分析，這可能與盧氏縣某些種植戶種植丹參有兩年采收的習(xí)慣有關(guān)。

3 討論

3.1 丹參質(zhì)量總體評價

表5 35批丹參相似度

從含量測定和指紋圖譜結(jié)果看，丹參質(zhì)量較好，基本都能滿足藥典規(guī)定的要求，且各地產(chǎn)丹參化學(xué)成分差異不大，丹參整體質(zhì)量水平較高，這與有關(guān)報道的結(jié)論一致[12]。但浸出物含量方面，各地丹參差異明顯，尤其是不同產(chǎn)地的脂溶性浸出物含量相差3倍左右。

3.2 各地丹參質(zhì)量比較

四川和山東為兩大丹參道地產(chǎn)區(qū)。山東丹參的核心產(chǎn)區(qū)為庫山地區(qū)，有文獻報道庫山丹參中丹參酮類含量較低[13]。本次研究從庫山地區(qū)采集的3個樣本中，丹參酮類含量分別為0.74%、0.74%、0.18%，均低于山東省平均值0.93%，與文獻報道一致。同時，庫山附近的旗山丹參酮類含量最高(1.46%)，這可能與丹參連作，產(chǎn)區(qū)向周邊轉(zhuǎn)移后，新的產(chǎn)區(qū)土壤環(huán)境較適合丹參酮類聚集有關(guān)。四川雁江為近幾年丹參的新產(chǎn)地，本次研究采集的2個樣品含量測定結(jié)果顯示，其水溶性浸出物、丹參酮類、丹酚酸B含量均較高，質(zhì)量較好。

目前研究表明，丹參中的脂溶性有效成分合計多達50余種[14]，在抗炎、抗腫瘤、抗心血管疾病方面有較高活性[15]。故下一步可對不同產(chǎn)區(qū)丹參的脂溶性成分差異開展深入研究。