電針智三針對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及EphA4/ephrinA3蛋白表達的影響

林 吉，魏宇唯，唐中生，朱正耀，朱世杰，寇云芳，謝高宇

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

血管性癡呆(Vascular dementia,VaD)是指由缺血性卒中、出血性卒中和造成記憶、認(rèn)知和行為等腦區(qū)低灌注的腦血管疾病所致的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征，已經(jīng)成為僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)的致精神和軀體殘疾的主要因素之一，缺血性中風(fēng)幸存者中有25%～30%會發(fā)展為立即或延遲的血管性認(rèn)知障礙(Vascular cognitive impairment，VCI)或血管性癡呆(VaD)[1]。與AD不同，VaD是一種完全可預(yù)防、系統(tǒng)治療后能有效改善癥狀的疾病。因此，在疾病早期有效防治VaD有重大社會意義。有研究表明，突觸功能障礙在VCI和VaD的認(rèn)知能力下降過程中，是造成學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知障礙的主要原因之一[2]。促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生的肝細(xì)胞受體(Erythropoietin-producing hepatocellular receptor，Eph)/肝配蛋白 (Ephrin)家族蛋白是酪氨酸激酶家族的最大成員[3]，按其序列同源性及與配體親和力可分為兩個亞組：EphA和EphB，Eph家族蛋白在人體各大系統(tǒng)均有作用，但對于其在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用機制的研究最為廣泛，研究顯示，Eph/ephrin信號通路在神經(jīng)細(xì)胞遷移、軸突導(dǎo)向、自動調(diào)節(jié)細(xì)胞接觸、調(diào)節(jié)大腦細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)腦血管生成中扮演了重要角色[4]。

研究證明，神經(jīng)損傷可使大鼠海馬CA1區(qū)EphA4與ephrinA3的表達明顯增高，EphA4/ephrin信號通路通過調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞參與腦缺血后的炎性損傷的過程[5]。但這一信號通路與VaD相關(guān)性尚不明確，本實驗通過制備VaD大鼠模型，分析VaD大鼠海馬CA1區(qū)EphA4/ephrinA3蛋白表達、血清白細(xì)胞介素-6(IL-6)、C反應(yīng)蛋白(CRP)含量的變化，繼續(xù)探討電針智三針改善VaD大鼠學(xué)習(xí)記憶的可能機制，以期為臨床電針智三針治療VaD提供理論依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量約300～350 g,長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號:SCXK (湘) 2014-0011。

1.2 儀器

手術(shù)器械1套,華佗牌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠，0.3 mm×40 mm)；電泳儀(Tanon，EPS-300)；超聲波細(xì)胞粉碎機(寧波榮順，RS-25S)；華佗牌SDZ-Ⅱ型電針治療儀 (蘇州醫(yī)療用品廠)；電子分析天平 (日本島津，AUW-220D)；板式酶標(biāo)儀(北京新風(fēng)機電，ZS-2)；立式超低溫保存箱(Haier，DW-86L386)；微孔板恒溫振蕩器(杭州米歐，ST70-2)；高速冷凍離心機(湘儀貝克，TGL-20M)等。

1.3 藥品與試劑

尼莫地平片(亞寶藥業(yè)集團股份有限公司,國藥準(zhǔn)字H14022821)；戊巴比妥鈉(P3761,Sigma)；BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀(jì),CW0014)；一步法快速Western印跡試劑盒(康為世紀(jì)，兔CW02029、鼠CW02030)；ECL發(fā)光檢測試劑盒(康為世紀(jì)，CW0049)；蛋白酶抑制劑(康為世紀(jì)，CW2200S)；蛋白印跡膜再生液(康為世紀(jì),CW0056)；Eph A4(博奧森，bs-1455R)；Ephrin A3(博奧森,bs-6047R)；IL-6(Elabscience，E-EL-R0015c)；CRP(Elabscience，E-EL-R0022c)等。

2 方法

2.1 VaD大鼠模型制備

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，術(shù)前禁食12 h，禁水4 h后開始造模。用3%戊巴比妥鈉(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，將其俯臥位固定于手術(shù)臺上，在第1頸椎上方縱向剪開一個小口，用鑷子鈍性分離肌肉，暴露出頸椎翼小孔，用直徑0.5 mm電凝針插入頸椎翼小孔灼燒椎動脈1～2 s，使其永久性閉塞。24 h后，分離雙側(cè)頸總動脈，左、右頸總動脈分別不同時夾閉5 min，共夾閉3次，每次間隔10 h。假手術(shù)組除不結(jié)扎動脈外，其余操作相同。

2.2 實驗動物分組

將造模成功的大鼠按照前期課題組的設(shè)計隨機分組[6]：VaD模型組、尼莫地平組、電針智三針組，再配以假手術(shù)組進行比較，每組10只。

2.3 治療方法

術(shù)后第8天開始治療，治療時間為每天上午9點至11點，每日治療1次，連續(xù)治療20天，電針智三針操作均由同一人完成。電針智三針組：使用特制的固定器固定好大鼠頭部及四肢后，參照華興邦《實驗動物穴位圖譜》，以百會穴作為參照，于大鼠百會穴正中前下方2 mm處取神庭穴,神庭穴兩側(cè)旁開0.5 mm處取本神穴,采用1寸毫針于皮下平刺進針0.5寸，連接電針儀，施予連續(xù)波，20 Hz,治療20 min。尼莫地平組:按課題組之前的方法進行，每只大鼠按20 mg/(kg·d)的用量進行灌胃治療。VaD模型組和假手術(shù)組:每只大鼠每天給予1 mL/100 g蒸餾水灌胃。

2.4 Morris水迷宮測試大鼠行為學(xué)

定位航行實驗：將平臺固定于第一象限，水面高于平臺1 cm，水溫25～27 ℃之間。第1～6天進行定位航行實驗,以水迷宮四周的標(biāo)志為參照物，每天分別將大鼠從平臺以外的其他3個不同象限面向池壁放入水中，記錄找到平臺所用時間,如未在規(guī)定時間內(nèi)找到平臺,引導(dǎo)大鼠站在平臺上并停留10 s記憶參照物及路線,時間記為90 s。

空間探索實驗：上述實驗完成后次日，撤除平臺，將大鼠從第三象限放入水中，記錄90 s內(nèi)大鼠穿越平臺區(qū)域次數(shù)。

2.5 ELISA檢測血清IL-6、CRP含量

用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,腹主動脈采血3 000 r/min離心20 min取上清，收集血清分裝保存于-20 ℃冰箱備用。按照試劑盒說明書測定IL-6、CRP含量。

2.6 Western Blot檢測海馬CA1區(qū)EphA4/ephrinA3蛋白表達

用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，于劍突處剪開胸壁，暴露心臟，從主動脈根部用生理鹽水充分灌洗，之后迅速斷頭取腦，于冰上剝離兩側(cè)海馬。-80℃保存?zhèn)溆?，等比例加入含蛋白抑制劑的裂解液，提取各組大鼠海馬組織蛋白。取上清液用BCA法進行蛋白定量，離心收集上清;30%Acr-Bis分離膠緩沖液,10%APS TEMED混勻,制備10%分離膠,靜置30～60 min靜置30～60 min，上樣,20 mA恒流電泳,待預(yù)染Marker條帶分離清晰、間距適宜時,停止電泳。200 mA恒流,低溫轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束,使用一步法快速Western印跡試劑盒(康為世紀(jì)鼠CW2030,兔CW2029),加入封閉液中,20 min;另取二抗HRP至4 mL離心管中,再取一抗與二抗混勻,室溫孵育5 min,加入一步法抗體稀釋液。滴加ECL發(fā)光液顯影，以β-actin為內(nèi)參。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較用 LSD檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠空間學(xué)習(xí)能力檢測結(jié)果

與假手術(shù)組相比，VaD模型組大鼠搜尋平臺時間明顯延長(*P<0.05，**P<0.01)，表明造模后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力會出現(xiàn)明顯下降，證明VaD模型建立成功；電針智三針組和尼莫地平組尋找平臺所用時間比VaD模型組明顯縮短(△P<0.05，△△P<0.01),證明電針智三針能提高VaD大鼠學(xué)習(xí)能力。見表1。

表1 各組大鼠搜尋平臺時間

3.2 各組大鼠空間探索能力檢測結(jié)果

上述實驗完成后次日，撤除平臺，將大鼠從第三象限放入水中，記錄到VaD模型組大鼠穿越平臺象限次數(shù)明顯低于假手術(shù)組(P<0.01)，說明VaD大鼠空間探索能力下降，電針智三針組穿越平臺區(qū)域次數(shù)明顯增加(P<0.05)，說明電針智三針能提高VaD大鼠空間記憶能力。見表2。

表2 各組大鼠穿越平臺次數(shù) 次)

3.3 各組大鼠IL-6、CRP含量的變化

與假手術(shù)組比較，VaD模型組血清IL-6含量增加(P<0.05)、血清CRP含量顯著增加(P<0.01)。說明造模后大鼠腦缺血會產(chǎn)生全身性的炎癥反應(yīng)。與VaD模型組比較，電針智三針組大鼠血清IL-6、CRP含量降低(P<0.05)。說明電針智三針治療后，減輕VaD大鼠腦缺血后的炎癥反應(yīng)。見表3。

表3 各組大鼠血清IL-6、CRP含量

3.4 各組大鼠海馬CA1區(qū)EphA4/ephrinA3含量的變化

與假手術(shù)組比較，VaD模型組海馬CA1區(qū)EphA4蛋白表達增加(P<0.01)，ephrinA3蛋白表達增加(P<0.05)；與VaD模型組比較，電針智三針大鼠海馬CA1區(qū)EphA4蛋白表達降低(P<0.01)；ephrinA3蛋白表達降低(P<0.05)。見圖1、表4。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)EphA4/ephrinA3蛋白含量的表達

表4 各組大鼠海馬CA1區(qū)EphA4/ephrinA3蛋白含量的表達

4 討論

近年來，血管性癡呆(VaD)發(fā)病率正在迅速增加，在公共衛(wèi)生和社會護理方面遭成了嚴(yán)重困擾，全世界大約有4 680萬人患有癡呆癥，每年有990萬新增病例[7]。因此，怎樣有效防治VaD成了目前癡呆和腦缺血領(lǐng)域的一個熱點。智三針由靳瑞教授所創(chuàng)，其主要選取位于前額部的神庭穴和雙側(cè)的本神穴，神庭穴在左右額肌的交界處，布有額神經(jīng)分支，本神穴位于額肌中，布有額神經(jīng)外側(cè)支，三個穴位正對應(yīng)大腦額葉,額葉功能與記憶、判斷、認(rèn)知、思考、操作密切相關(guān)[8]。

腦缺血時,細(xì)胞興奮毒性增強和能量衰竭,激發(fā)腦實質(zhì)內(nèi)的炎癥反應(yīng)，其中IL-6是一種由多種炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，能夠誘導(dǎo)磷脂酶合成分泌，經(jīng)花生四烯酸途徑形成氧自由基，刺激溶酶體釋放，進而加重腦組織缺血缺氧和神經(jīng)損傷[9]，其效應(yīng)與濃度相關(guān)，IL-6通過影響突觸可塑性、神經(jīng)元形態(tài)而影響認(rèn)知功能。動物研究表明，腦缺血大鼠認(rèn)知功能和行為改善與腦內(nèi)的炎癥因子IL-6水平密切相關(guān)[10]，當(dāng)IL-6濃度較低時,具有神經(jīng)修復(fù)的作用,提高學(xué)習(xí)記憶能力。腦內(nèi)缺血損傷使細(xì)胞膜發(fā)生分離，提高了CRP的附著點，在IL-6的信息傳導(dǎo)下，有活性的CRP隨之產(chǎn)生[11]。CRP是判斷炎性反應(yīng)的重要指標(biāo)之一，具有抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展及減輕炎癥損傷的作用。正常情況下血清含量極少，當(dāng)體內(nèi)發(fā)生炎癥時迅速釋放升高，且其濃度與炎癥嚴(yán)重程度呈正比[12]。VaD大鼠模型中，CRP升高直接導(dǎo)致白細(xì)胞介素 (IL-1、IL-6)和自由基的大量釋放，引起血管痙攣，導(dǎo)致海馬組織缺血、缺氧。此外，CRP分解產(chǎn)生的多肽可以調(diào)節(jié)免疫活性，促進局部免疫調(diào)節(jié)障礙，加重神經(jīng)損傷的程度，出現(xiàn)認(rèn)知障礙[13]。

本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)VaD模型組血清IL-6含量明顯高于假手術(shù)組，說明炎癥反應(yīng)參與了腦缺血繼發(fā)性損傷的過程，而電針智三針治療后，血清IL-6含量下降，證明電針智三針的治療減輕了VaD大鼠炎癥反應(yīng)，VaD大鼠的認(rèn)知功能得到明顯改善。也證實在VaD模型組大鼠中，血清CRP含量高于假手術(shù)組，而電針智三針治療可以下調(diào)血清中CRP的含量，從而減輕VaD大鼠神經(jīng)損傷的程度，有效改善VaD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

研究發(fā)現(xiàn)，與其他記憶障礙疾病一樣，引起VaD的認(rèn)知障礙的原因之一是突觸功能障礙甚至是喪失。EphA受體調(diào)節(jié)海馬組織的功能和可塑性[14]。研究顯示，腦缺血損傷可增加CA1區(qū)ephrinA3和EphA4蛋白的表達，EphA4可能通過肌動蛋白細(xì)胞骨架重組或黏附受體調(diào)節(jié)，并以蛋白酶體依賴性方式觸發(fā)AMPA受體降解，EphA4與ephrinA3相互產(chǎn)生作用，其過程涉及突觸修剪[15]。最新研究結(jié)果表明，抑制EphA4可以改善認(rèn)知障礙小鼠模型中的社會記憶能力和認(rèn)知功能，同時可觀察到海馬CA1區(qū)突觸形態(tài)發(fā)生改變，其改變特征是樹突棘長度和頭部寬度增加[16]。EphA4/ephrinA3在正常成人神經(jīng)系統(tǒng)中表達水平極低，在神經(jīng)損傷及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化時表達上調(diào)，EphA4缺乏會增加神經(jīng)膠質(zhì)谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的水平，而ephrinA3會調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運蛋白電流。研究表明，EphA4/ephrinA3信號傳導(dǎo)是神經(jīng)細(xì)胞調(diào)節(jié)突觸功能和可塑性的關(guān)鍵機制[14]。本研究采用電針智三針為治療方法，發(fā)現(xiàn)電針智三針組大鼠海馬CA1區(qū)EphA4/ephrinA3蛋白表達較VaD組呈下降趨勢，提示電針智三針能調(diào)節(jié)突觸的功能可塑性，有利于改善VaD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。

本課題組早期研究證實電針智三針可能通過調(diào)節(jié)海馬CA1區(qū)突觸前膜EphB2和突觸后膜ephrinB3表達，來改善VaD大鼠認(rèn)知功能[6]。此次實驗通過電針智三針對大鼠海馬CA1區(qū)EphA4/ephrinA3蛋白表達的影響，從另一個角度探討了電針智三針對VaD大鼠認(rèn)知功能改善的可能機制。本實驗在制備VaD大鼠的基礎(chǔ)上，應(yīng)用電針智三針干預(yù)治療，觀察不同組別大鼠血清IL-6、CRP含量的變化以及海馬CA1區(qū)EphA4、ephrinA3蛋白的表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：電針智三針治療后，VaD大鼠海馬CA1區(qū)EphA4、ephrinA3蛋白表達降低，同時下調(diào)了血清IL-6、CRP的含量，從而保護大鼠腦組織,減輕神經(jīng)損傷程度，明顯提高了VaD大鼠的認(rèn)知功能。該研究為臨床電針智三針治療VaD提供了一定的理論和實驗依據(jù)，至于EphA4/ephrinA3通路是通過何種途徑發(fā)揮作用的，課題組還將圍繞EphA4/ephrinA3通路繼續(xù)探討電針智三針改善VaD學(xué)習(xí)記憶的可能機制。