UPLC法測(cè)定大鼠血清中蓽茇寧含量及變化規(guī)律

烏云索德，領(lǐng) 小，孟 和，昭日格圖

(1.內(nèi)蒙古大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

蓽茇(Long pepper)是胡椒科植物蓽茇(PiperlongumL.)的干燥近成熟或成熟果穗[1]，具有溫中散寒、理氣止痛的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蓽茇具有顯著的降血脂作用，降血脂活性成分為蓽茇寧(piperlonguminine，GBN)[2-5]。藥物必須進(jìn)入血液循環(huán)才能產(chǎn)生作用，血液中藥物的性質(zhì)、濃度決定了其藥效和毒性[6]。超高液相色譜法(UPLC)具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于藥物分析測(cè)定[7-9]。本研究采用超高效液相色譜儀建立了大鼠血清中蓽茇寧的含量測(cè)定方法并觀察不同給藥量與血液中藥物濃度的關(guān)系。該方法操作便捷、靈敏度高、選擇性好，可為蓽茇寧的吸收、代謝規(guī)律研究和臨床合理用藥提供參考依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 儀器

Waters Acquity UPLCTM超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司，配有恒溫自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器、柱溫箱、Empower2色譜工作站)；MTN-2800D氮吹儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；TGL-16G冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；QL-901漩渦混合器(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)；KQ-300VDE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；EL204-IC電子天平(上海 METTLER TOLEDO儀器有限公司)；Millipore-Q Plus超純水器(美國(guó) Millipore公司)；RAININ 1 000 μL移液槍(上海 METTLER TOLEDO儀器有限公司)等。

1.2 材料

蓽茇寧(自制，純度>98%)；乙腈(色譜純，美國(guó)TEDIA公司)；水為超純水；其余試劑為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar雄性大鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供(生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2012-0001)，體重為(200±20)g。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取50 mg蓽茇寧，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成1 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱中保存。測(cè)定前用無(wú)水乙醇稀釋得不同濃度的對(duì)照品溶液，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 給藥樣品制備及給藥方法

采用0.5%的CMC-Na將蓽茇寧制成不同濃度的混懸液，大鼠隨機(jī)分成空白組和5個(gè)給藥組，5個(gè)給藥組分別按照50 mg·kg-1、100 mg·kg-1、200 mg·kg-1、500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)灌胃3 d。末次給藥后0.5 h、1 h、2 h、2.30 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h取血，放置30 min，3 000 rpm離心15 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血清樣品處理方法

取大鼠血清500 μL，加入4倍量乙腈，渦漩混合1 min，10 000 rpm離心15 min，取上清液，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)尤?50 μL乙腈，渦漩溶解30 s，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，進(jìn)行UPLC分析。

2.4 色譜條件和分析條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH shield RP18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters Corporation，USA)，流動(dòng)相：乙腈-水(1∶1)，檢測(cè)波長(zhǎng)：338 nm，流速：0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量：2 μL；色譜柱溫度：25 ℃。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法專屬性

取大鼠空白血清、加入蓽茇寧標(biāo)準(zhǔn)品的空白血清、大鼠灌胃蓽茇寧后的血清，分別按血清樣品處理方法操作(“2.3”項(xiàng)下方法)，各樣品分別取2 μL注入超高效液相色譜儀，得到UPLC色譜，見(jiàn)圖1。由色譜圖可知，蓽茇寧的保留時(shí)間為1.98 min，給藥血清樣品色譜分離良好，血清內(nèi)源性物質(zhì)不干擾蓽茇寧的測(cè)定。

(a)：空白血清；(b)：空白血清中加入蓽茇寧；(c)：大鼠灌胃蓽茇寧后血清

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

取空白血清500 μL，加入蓽茇寧標(biāo)準(zhǔn)系列溶液50 μL，配制成蓽茇寧濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、15.0 μg·mL-1的血清樣品。按照“2.3”項(xiàng)下血清樣品處理操作，取2 μL注入超高效液相色譜儀，得UPLC色譜建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以蓽茇寧濃度為橫坐標(biāo)，蓽茇寧峰面積為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，得到線性方程y=68.45x-52.24(r=0.999 3，加權(quán)因子為1/x)，表明血清中蓽茇寧在0.5～15.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積積分線性關(guān)系良好(見(jiàn)圖2)，定量限為0.5 μg·mL-1(信噪比>3)。

圖2 空白血清加入系列濃度的蓽茇寧后處理得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 精密度和準(zhǔn)確度

取500 μL空白血清，加入適量蓽茇寧標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到低、中、高3個(gè)濃度(0.5、5.0、10.0 μg·mL-1)的質(zhì)控樣品各5份，測(cè)定日內(nèi)及日間精密度。每天1次，連續(xù)測(cè)定5 d日間精密度(結(jié)果見(jiàn)表1)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，日內(nèi)及日間精密度(RSD)均小于6%，說(shuō)明該方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度。

表1 大鼠血清中蓽茇寧的日間和日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度測(cè)定 (n=5)

3.4 穩(wěn)定性

分別配制低、中、高3種濃度的蓽茇寧大鼠血清樣品，于室溫放置，每隔2 h進(jìn)樣分析1次，考察蓽茇寧在樣品測(cè)定過(guò)程中的穩(wěn)定性。每一濃度進(jìn)行3次分析，結(jié)果表明樣品室溫放置24 h穩(wěn)定。

3.5 回收率

取大鼠空白血清500 μL，按照“3.2”項(xiàng)下方法制備低、中、高3種濃度(0.5、5.0、10.0 μg·mL-1)的質(zhì)控樣品，每種濃度進(jìn)行5次分析。另用乙腈代替血清，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理，制備相應(yīng)濃度的樣品，每種濃度進(jìn)行5次樣本分析，獲得相應(yīng)峰面積。結(jié)果表明回收率均大于65%，比較穩(wěn)定，結(jié)果見(jiàn)表2。絕對(duì)回收率=測(cè)得樣品濃度(C測(cè))/理論樣品濃度(C理論)。

表2 大鼠血清中蓽茇寧的回收率測(cè)定 (n=5)

3.6 樣品測(cè)定

將Wistar大鼠分成6個(gè)組，分別為空白組和5個(gè)給藥組(灌胃給藥劑量分別為50 mg·kg-1、100 mg·kg-1、200 mg·kg-1、500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1)，連續(xù)灌胃3 d，末次給藥后分別于0.5 h、1 h、2 h、2.30 h、3 h、4 h、6 h、8 h和12 h取血。采血后放置30 min，在3 000 rpm條件下離心15 min，取上清液。按照“2.4”項(xiàng)下方法處理，獲得血清樣品色譜，測(cè)定血清中蓽茇寧的濃度，測(cè)得藥時(shí)曲線見(jiàn)圖3。

圖3 大鼠灌胃不同劑量蓽茇寧后的血藥濃度-時(shí)間曲線

隨著灌胃劑量的增加，進(jìn)入血液中蓽茇寧的濃度也有增加的趨勢(shì)。5個(gè)劑量以200 mg·kg-1為界限出現(xiàn)兩種不同的情況：200 mg·kg-1以下劑量，即50 mg·kg-1、100 mg·kg-1時(shí)，第1次出現(xiàn)最大血藥濃度的時(shí)間為1 h，第2次出現(xiàn)最大血藥濃度的時(shí)間為3 h；200 mg·kg-1以上劑量，即500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1時(shí)，第1次出現(xiàn)最大血藥濃度的時(shí)間為0.5 h。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，UPLC法具有靈敏度高、選擇性好、前處理方法簡(jiǎn)單、回收率穩(wěn)定、分析時(shí)間短(僅需5 min)的優(yōu)勢(shì)，適用于大鼠血清中蓽茇寧的定性定量快速測(cè)定。

血藥濃度和時(shí)間曲線表明，隨著給藥劑量的增加，大鼠血清中的蓽茇寧濃度也逐漸升高。考慮到大鼠的個(gè)體差異性，灌胃給藥后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蓽茇寧血清濃度是以曲線的形式下降的。