環(huán)氧化物水解酶交聯(lián)細(xì)胞聚集體催化合成（R）-環(huán)氧氯丙烷

鄒樹平，姜鎮(zhèn)濤，王志才，柳志強(qiáng)，鄭裕國

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院手性生物制造國家地方聯(lián)合工程研究中心，浙江杭州310014）

引 言

手性環(huán)氧氯丙烷是重要的C3合成子，其中(S)?環(huán)氧氯丙烷（(S)?ECH）是降血脂藥物阿托伐他汀、降血壓藥物卡維地洛等醫(yī)藥的前體[1]；(R)?環(huán)氧氯丙烷（(R)?ECH）是治療心絞痛藥物美托洛爾和減肥藥物肉毒堿合成的關(guān)鍵中間體[2?3]。近年來，環(huán)氧氯丙烷生產(chǎn)工藝趨于成熟，規(guī)模逐年擴(kuò)大，成本和價(jià)格持續(xù)走低[4]，因此，利用消旋體環(huán)氧氯丙烷制備手性環(huán)氧氯丙烷具備巨大的經(jīng)濟(jì)效益與可行性[5?7]。環(huán)氧化物水解酶（epoxide hydrolase, EC 3.3.2.3），廣泛存在于自然界中，該酶可以將消旋體環(huán)氧化物立體選擇性水解生成手性環(huán)氧化物及相應(yīng)的鄰二醇[8]。由于反應(yīng)條件溫和、立體選擇率高、環(huán)境友好等優(yōu)勢，酶法催化合成手性環(huán)氧氯丙烷受到廣泛關(guān)注[9?11]（圖1）。

生物催化劑在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，往往存在操作穩(wěn)定性差、難以重復(fù)使用、使用成本高等問題，而這些問題通?？赏ㄟ^細(xì)胞或酶的固定化得到解決[12?13]。目前，大部分關(guān)于環(huán)氧化物水解酶固定化主要通過海藻酸鈣[14]、環(huán)氧樹脂[15]、DEAE?cellulose[16]、磁性納米顆粒[17]等進(jìn)行固定化，這些方法實(shí)現(xiàn)了環(huán)氧化物水解酶熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性一定程度的提高，但仍存在一些缺點(diǎn)，如固定化顆粒機(jī)械強(qiáng)度低、傳質(zhì)阻力高、非催化功能的載體占比大等。交聯(lián)細(xì)胞聚集體（CLCAs）是利用絮凝?交聯(lián)技術(shù)將全細(xì)胞固定化的一種新方法，具有操作簡單、成本低、細(xì)胞活力回收率高、比活性高、操作穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[18?19]，具有巨大的工業(yè)應(yīng)用潛力。

本實(shí)驗(yàn)室在前期將放射形農(nóng)桿菌環(huán)氧化物水解酶基因在大腸桿菌BL21（DE3）中高效表達(dá)[20]，對(duì)環(huán)氧化物水解酶進(jìn)行迭代飽和突變，獲得了立體選擇性和催化效率大幅度提高的環(huán)氧化物水解酶突變體I108L/D131S/T247K[21]，并通過建立兩相催化體系克服了底物的自發(fā)水解。本研究以重組表達(dá)環(huán)氧化物水解酶突變體的重組大腸桿菌BL21（DE3）為全細(xì)胞催化劑，建立了環(huán)氧化物水解酶交聯(lián)細(xì)胞聚集體的制備方法，并利用環(huán)氧化物水解酶交聯(lián)細(xì)胞聚集體催化合成(R)?ECH，旨在為手性環(huán)氧氯丙烷的生物制造新技術(shù)開發(fā)提供指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和試劑 本實(shí)驗(yàn)所用菌株為實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b?EH I108L/D131S/T247K[21]。50%聚乙烯亞胺（PEI）購自上海晶純生化科技股份有限公司。海藻酸鈉、聚乙烯醇（分子量10000）、卡拉膠、25%戊二醛（GA）、硅藻土等試劑與原材料均為市售。異辛烷為市售分析純?？敲顾睾彤惐虼?β?D?半乳糖苷（IPTG）購于Sigma公司，酵母粉、蛋白胨購自O(shè)XOID公司，(R,S)?ECH（分析純）、(S)?ECH（98%）、(R)?ECH（98%）、3?氯?1,2?丙二醇（97%）均購于阿拉丁公司。除特別注明的試劑外，其他實(shí)驗(yàn)試劑均為國產(chǎn)分析純。

圖1 環(huán)氧化物水解酶交聯(lián)細(xì)胞聚集體的制備過程及催化合成(R)?ECHFig.1 Preparation process of cross?linked cell aggregates of epoxide hydrolase and its application for the synthesis of (R)?epichlorohydrin

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，LB 固體培養(yǎng)基中含1.8%瓊脂。高壓滅菌條件為121℃，20 min。

1.2 方法

1.2.1 環(huán)氧化物水解酶全細(xì)胞的制備 將活化后的環(huán)氧化物水解酶工程菌按2%（體積）的接種量接入裝有100 ml LB 培養(yǎng)基的500 ml 錐形瓶中，置于37℃、200 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的OD600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG作為誘導(dǎo)劑，28℃誘導(dǎo)10 h，離心收集菌體，?20℃保存。

1.2.2 交聯(lián)細(xì)胞聚集體（CLCAs）的制備 10 g 濕細(xì)胞加入100 ml 磷酸鹽緩沖液中（pH=7.0, 100 mmol/L）配成菌懸液，將500 g/L PEI 按質(zhì)量比稀釋10 倍，加入6 g/L 硅藻土攪拌30 min，再加入1%(體積)PEI進(jìn)行絮凝，攪拌30 min 后靜置10 min，然后加入1%(體積) GA 進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，攪拌30 min，最后通過真空抽濾回收，用0.9%生理鹽水洗滌三次，抽濾后濾餅保存于4℃冰箱中備用。

1.2.3 活力的測定 環(huán)氧化物水解酶全細(xì)胞活力測定采用氣相色譜進(jìn)行測定，10 ml反應(yīng)體系中加入100 mmol/L(R,S)?ECH，適量的游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞以及磷酸鹽緩沖液（200 mmol/L，pH 8.0），35℃下180 r/min 振蕩器反應(yīng)5 min，后取樣200 μl 于800 μl乙酸乙酯中萃取，取有機(jī)相無水硫酸鈉干燥后，進(jìn)行氣相檢測?；盍挝唬║）定義：在35℃、pH 8.0 條件下，在1 min 內(nèi)催化1 μmol ECH 水解所需要的酶量定義為1 U；比活力（U/g）定義為每克干重的細(xì)胞具有的總活力單位。固定化細(xì)胞的活力回收率計(jì)算公式如下：

1.2.4 交聯(lián)細(xì)胞聚集體催化合成（R）?ECH 一定比例異辛烷/磷酸鹽緩沖液（pH8.0）兩相體系40 ml，加入干重0.72g CLCAs混勻，35℃保溫10 min后加入一定濃度(R,S)?ECH，攪拌反應(yīng)40 min，期間取樣200 μl 加入800 μl 乙酸乙酯萃取，取有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥后進(jìn)行氣相檢測。

1.2.5 分析方法 手性ECH 分析方法：采用日本島津氣相色譜儀GC?14A 系統(tǒng)，色譜柱類型：BGB?175毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。色譜條件：柱溫90℃，進(jìn)樣室溫度220℃，F(xiàn)ID 檢測器220℃，保留7 min，載氣為He，流量為1.6 ml/min，分流比1∶40，保留時(shí)間：(S)?ECH 5.1 min，(R)?ECH 5.3 min。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞固定化方法的篩選

為了篩選環(huán)氧化物水解酶全細(xì)胞最適合的固定化方法，研究了4種不同的細(xì)胞固定化方法，涉及包埋法和絮凝?交聯(lián)法。測定了細(xì)胞活力回收率，以及循環(huán)5 次后全細(xì)胞的殘余活力。結(jié)果如表1所示。

表1 固定化方法的篩選Table 1 Screening of immobilization method

表1結(jié)果顯示，利用絮凝?交聯(lián)法制備的CLCAs活力回收率高達(dá)82.7%，且固定的細(xì)胞結(jié)合致密，不易脫落，循環(huán)5次后活力幾乎不損失，這和其他交聯(lián)法 固 定 化 細(xì) 胞 Bacillus subtilis ZJB?063 和Arthrobacter nitroguajacolicus ZJUTB06?99 研究結(jié)果相符[22?23]。然而，采用海藻酸鈣、聚乙烯醇?海藻酸鈣以及卡拉膠包埋的全細(xì)胞活力回收率普遍較低，甚至未表現(xiàn)出明顯活力，說明包埋法可能不適合該環(huán)氧化物水解酶全細(xì)胞的固定化，本實(shí)驗(yàn)室前期研究也證明海藻酸鈣包埋的效果一般[24]。

2.2 交聯(lián)細(xì)胞聚集體制備條件優(yōu)化

圖2 交聯(lián)法固定化過程中PEI（a）、GA（b）、硅藻土（c）用量的優(yōu)化Fig.2 Optimization of PEI(a)，GA(b)and diatomite(c)concentration in the process of cross?linking immobilization

制備交聯(lián)細(xì)胞聚集體時(shí)，對(duì)催化能力影響較大的因素一般為絮凝劑、交聯(lián)劑和載體的用量[22?23]，因此，對(duì)交聯(lián)細(xì)胞聚集體制備過程中的PEI、GA 和硅藻土用量進(jìn)行優(yōu)化。如圖2 所示，考察了交聯(lián)細(xì)胞聚集體活力回收率和操作穩(wěn)定性。隨著PEI 和GA濃度增加，細(xì)胞活力回收率降低，操作穩(wěn)定性提高[圖2(a)、(b)]，由于細(xì)胞經(jīng)過PEI 和GA 的交聯(lián)后，固定化顆粒表面包裹一層紅色的聚合物膜，且該膜致密度以及機(jī)械強(qiáng)度隨PEI、GA 濃度增加而增大，與此同時(shí)會(huì)造成傳質(zhì)阻力增大[25?26]。綜合考慮，選擇3%（體積）PEI，1%（體積）GA 為最佳濃度。硅藻土不僅具有吸附和抗溶脹效果，還具有塑形、助濾和改善固定化顆粒傳質(zhì)特性的作用，并且價(jià)格相對(duì)較低[27]。當(dāng)以硅藻土為載體時(shí)，隨著硅藻土質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加固定化細(xì)胞活力回收率增加，而機(jī)械強(qiáng)度下降[圖2(c)]，綜合考慮，選擇6 g/L 的硅藻土為最適添加量。在PEI濃度、GA 濃度及硅藻土載體用量分別為3% (體積)和1%(體積)和6 g/L 條件下，交聯(lián)細(xì)胞聚集體活力回收率可達(dá)88.4%。

2.3 兩相中環(huán)氧化物水解酶交聯(lián)細(xì)胞聚集體催化合成（R）-ECH

由于環(huán)氧化物對(duì)生物催化劑有毒害作用，且化學(xué)性質(zhì)活潑，在單一水相中易發(fā)生自發(fā)水解反應(yīng)，導(dǎo)致反應(yīng)效率不高，而應(yīng)用有機(jī)溶劑/緩沖液兩相體系能夠克服這一缺點(diǎn)[28?30]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期關(guān)于有機(jī)溶劑對(duì)環(huán)氧化物水解酶催化反應(yīng)的影響研究結(jié)果[31]，確定了異辛烷/磷酸鹽緩沖液為最佳的兩相體系。本文中進(jìn)一步研究了兩相體系的異辛烷比例和底物負(fù)載量。如圖3(a)所示，隨著反應(yīng)體系中異辛烷含量的增加，活力逐步提高并在異辛烷含量為30%時(shí)達(dá)到最高，后迅速降低。這主要是由于：一方面，異辛烷的添加導(dǎo)致大部分底物分配于有機(jī)相中，在水相中保持較低的濃度，減少了底物對(duì)水相中菌體的毒害作用。另一方面，高濃度異辛烷會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致活力降低甚至失活[31]。因此，確定兩相體系中異辛烷/磷酸鹽緩沖液的最佳比例為3∶7。由于非天然的有機(jī)底物(R,S)?ECH 對(duì)細(xì)胞有一定毒害性[32]，有必要考察底物濃度對(duì)生物催化反應(yīng)的影響。如圖3(b)所示，當(dāng)?shù)孜餄舛刃∮?00 mmol/L 時(shí)，(R,S)?ECH 轉(zhuǎn)化完全，(R)?ECH 的ee 值都能達(dá)到99%以上，而進(jìn)一步提高底物濃度，(S)?ECH不能被完全水解，(R)?ECH 的ee值迅速降低，這可能是因?yàn)楦哂袡C(jī)底物濃度對(duì)細(xì)胞有毒害作用，從而對(duì)ECH的水解存在抑制作用[31]。

圖3 兩相體系中反應(yīng)參數(shù)對(duì)(R)?ECH合成的影響(a)異辛烷比例對(duì)細(xì)胞活力的影響;(b)底物濃度對(duì)(R)?ECH ee值的影響Fig.3 Effect of reaction parameters on(R)?ECH synthesis in biphase system(a)effect of isooctane ratio on cell activity;(b)effect of substrate concentrations on ee of(R)?ECH

為了進(jìn)一步提高催化效率、保證產(chǎn)物光學(xué)純度，在反應(yīng)進(jìn)程中補(bǔ)加全細(xì)胞催化劑已被證明是可行的策略[33]。因此嘗試通過補(bǔ)加CLCAs的方式提高底物負(fù)載和催化效率。如圖4 所示，在800 mmol/L底物濃度下催化反應(yīng)進(jìn)程曲線顯示(S)?ECH 在2 min 左右被反應(yīng)完全，此時(shí)(R)?ECH 剩余361 mmol/L，收率為45.2%[圖4(a)]。進(jìn)一步提高底物濃度至1 mol/L，(R)?ECH ee 值為70%左右[圖4(b)]；間歇補(bǔ)加干重0.5g 的CLCAs 后，反應(yīng)進(jìn)行到15 min 時(shí)(R)?ECH ee 值可達(dá)100%，收率為32%左右[圖4(c)]。連續(xù)流加干重0.5g 的CLCAs 后，反應(yīng)進(jìn)行到30 min 時(shí)(R)?ECH ee 值可達(dá)100%，收率約為31%[圖4(d)]?？梢钥闯?，底物濃度提高至1mol/L 后通過補(bǔ)加催化劑可使(R)?ECH ee 值達(dá)到100%，但收率明顯下降。補(bǔ)加的CLCAs 活力僅為初始CLCAs 的35%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞補(bǔ)加前副產(chǎn)物3?氯?1,2?丙二醇（3?MCP）濃度積累到520 mmol/L（其中(S)?3?MCP約410 mmol/L；(R)?3?MCP 約110 mmol/L）。可能存在的產(chǎn)物抑制導(dǎo)致菌體活力下降，較高濃度(S)?3?MCP 抑制殘余的(S)?ECH 水解，而(R)?ECH 所受抑制并不明顯，進(jìn)而縮小了兩種構(gòu)型底物反應(yīng)速率，最終導(dǎo)致(R)?ECH收率下降。

為了驗(yàn)證是否存在產(chǎn)物抑制，研究了不同3?MCP 濃度對(duì)活力的影響和3?MCP 存在時(shí)對(duì)反應(yīng)進(jìn)程的影響。如圖5(a)所示，相比于對(duì)照組，添加3?MCP的菌體活力顯著降低，且隨著3?MCP 濃度增加至300 mmol/L，活力大幅下降。圖5(b)展示了副產(chǎn)物存在時(shí)對(duì)催化反應(yīng)進(jìn)程的影響。以1 mol/L(R,S)?ECH 反應(yīng)后的上清液（包含395 mmol/L (R)?ECH，90 mmol/L(S)?ECH 和515 mmol/L 3?MCP）[反應(yīng)（1）]和人工配制的395 mmol/L (R)?ECH，90 mmol/L (S)?ECH 混合液[反應(yīng)（2）]為底物，進(jìn)行反應(yīng)，可以發(fā)現(xiàn)反應(yīng)（2）中(S)?ECH 被迅速消耗殆盡，(R)?ECH ee 值在1 min 內(nèi)即達(dá)到100%，而在含有產(chǎn)物3?MCP 的反應(yīng)（1）中，初始反應(yīng)速率不到反應(yīng)（2）的1/3，(R)?ECH ee 值在12.5 min 時(shí)才達(dá)到99%，從而證實(shí)催化反應(yīng)存在不可忽視的產(chǎn)物抑制問題。

綜上所述，在兩相中環(huán)氧化物水解酶交聯(lián)細(xì)胞聚集體催化合成(R)?ECH 的體系中，在異辛烷與緩沖液的體積比3∶7，底物濃度800 mmol/L，CLCAs 加入量18 g/L，緩沖液pH 8.0，溫度35℃條件下，(R)?環(huán)氧氯丙烷的摩爾產(chǎn)率可達(dá)到45.2%，產(chǎn)物光學(xué)純度為99.1%ee。與已報(bào)道的生物法合成(R)?ECH 研究[10,24,29,34?35]相比，本研究建立的800 mmol/L 底物濃度和45.2%的(R)?ECH收率均已處于較高水平。

2.4 CLCAs的操作穩(wěn)定性

在異辛烷/磷酸鹽緩沖液兩相體系中，(R,S)?ECH濃度800mmol/L，添加干重18 g/L CLCAs進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)CLCAs進(jìn)行抽濾回收，添加新鮮底物與有機(jī)溶劑進(jìn)行下一批反應(yīng)，如圖6所示，CLCAs在9個(gè)循環(huán)使用后活力幾乎不損失，且(R)?ECH的ee值均能達(dá)到99%。由于反應(yīng)過程中機(jī)械攪拌且高底物濃度底物易導(dǎo)致游離細(xì)胞破損，在8000 r/min條件下離心10 min回收細(xì)胞時(shí)泄漏的環(huán)氧化物水解酶導(dǎo)致活力損失，因此游離細(xì)胞循環(huán)使用4次后，活力僅為初始的30%。因此，CLCAs顯著提高了細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度，顯示了良好的操作穩(wěn)定性[12]。

圖4 兩相體系中交聯(lián)細(xì)胞聚集體催化合成(R)?ECH反應(yīng)進(jìn)程曲線(a)800 mmol/L底物濃度;(b)1 mol/L底物濃度;(c)1mol/L底物濃度下間歇補(bǔ)加CLCAs;(d)1 mol/L底物濃度下連續(xù)流加CLCAs;綠色箭頭為開始補(bǔ)加,紫色箭頭為結(jié)束補(bǔ)加Fig.4 Reaction process of the synthesis of(R)?ECH catalyzed by CLCAs in biphase system(a)substrate concentration at 800 mmol/L;(b)substrate concentration at 1 mol/L;(c)substrate concentration at 1 mol/L with intermittent CLCAs addition;(d)substrate concentration at 1 mol/L with continuous CLCAs addition;the green arrow is the start of CLCAs addition and the purple arrow is the end of CLCAs addition

圖5 副產(chǎn)物3?氯?1,2?丙二醇對(duì)催化反應(yīng)的影響(a)3?氯?1,2?丙二醇濃度對(duì)酶活力的影響;(b)副產(chǎn)物3?氯?1,2?丙二醇存在時(shí)對(duì)(R)?ECH合成反應(yīng)進(jìn)展的影響Fig.5 Effect of 3?chloro?1,2?propanediol on the catalytic reaction(a)effect of 3?chloro?1,2?propanediol concentration on enzyme activity;(b)effect of 3?chloro?1,2?propanediol on the reaction process of the synthesis of(R)?ECH

圖6 交聯(lián)細(xì)胞聚集體與游離細(xì)胞的反應(yīng)批次Fig.6 Recycling batch of CLCAs and free cells

3 結(jié) 論

本文以重組環(huán)氧化物水解酶大腸桿菌工程菌為研究對(duì)象，建立了交聯(lián)細(xì)胞聚集體的制備方法，最佳制備條件為PEI 3%（體積）、GA 1%（體積）、硅藻土6 g/L，該條件下細(xì)胞表面的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)密度合適，兼顧了機(jī)械強(qiáng)度和傳質(zhì)速率，活力回收率可達(dá)到88.4%。同時(shí)開發(fā)了異辛烷/磷酸緩沖液兩相體系，異辛烷對(duì)底物溶解能力強(qiáng)，兩相體系緩解了底物ECH 在水相的自發(fā)水解，減輕了細(xì)胞在水相中受到的底物抑制和毒害，最大底物負(fù)載達(dá)到800 mmol/L。利用CLCAs 進(jìn)行催化合成(R)?ECH 反應(yīng)，(R)?ECH 濃度達(dá)到361 mmol/L，產(chǎn)物收率為45.2%，ee 值均＞99%，交聯(lián)細(xì)胞聚集體表面聚合物網(wǎng)絡(luò)有效提高了細(xì)胞操作穩(wěn)定性，重復(fù)使用9批次后，活力基本不變。CLCAs 具有優(yōu)越的催化性能，操作穩(wěn)定性好，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。