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    三萜類化合物抗病毒的構(gòu)效關(guān)系及其作用機制研究進展

    2020-09-29 01:17:06范炳芝王一鑫廉霄甜謝維松于洋梁建華
    化工學(xué)報 2020年9期
    關(guān)鍵詞:三萜類三萜甘草酸

    范炳芝,王一鑫,廉霄甜,謝維松,于洋,梁建華

    (北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,北京100081)

    引 言

    圖1 四環(huán)三萜和五環(huán)三萜的代表性骨架Fig.1 Representative skeletons of tetracyclic triterpenes and pentacyclic triterpenes

    三萜類(triterpenoids)化合物衍生自植物體內(nèi)甲羥戊酸(mevalonate pathway, MVA)或甲基赤蘚醇?4?磷 酸(2?C?methyl?D?erythritol 4?phosphate,MEP)途徑合成的異戊烯基焦磷酸(3?isopentenyl pyrophosphate, IPP)或二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate, DMAPP)[1]。通常由六個五碳的異戊二烯單元組成,以游離形式或與糖結(jié)合成苷存在于甘草、柴胡、人參、三七和黃芪等植物中;后者因具有親水親脂兩性,能產(chǎn)生肥皂般泡沫而得名皂苷。三萜類化合物種類繁多,其骨架超過100 種[2],以四環(huán)三萜和五環(huán)三萜最為常見。四環(huán)三萜的骨架類型主要有羊毛脂甾烷型(lanostane)、達瑪烷型(dammarane)、大戟烷型(euphane)、原萜烷型(protostane)、葫蘆烷型(cucurbitane);五環(huán)三萜的骨架類型主要有齊墩果烷型(oleanane)、烏蘇烷型(ursane)、羽 扇 豆 烷 型(lupane)和 木 栓 烷 型(friedelane)(圖1)。三萜類化合物具有廣泛的藥理活性,如抗腫瘤[3?4]、抗病毒[5?6]、抗菌[7?8]、抗炎[9?10]以及免疫調(diào)節(jié)[11]等,因此備受研究學(xué)者們的關(guān)注。近年來,多種三萜類化合物及其衍生物被證明具有顯著和廣譜的抗病毒活性,而有望作為新型廣譜抗病毒藥物應(yīng)用于臨床治療。

    病毒是引發(fā)人類疾病和威脅生命健康的主要原因之一,根據(jù)mRNA 生成機制不同可分為DNA 病毒、RNA 病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。其中,人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)、流感病毒(influenza virus)、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)、冠狀病毒(coronavirus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)、人 乳 頭 瘤 病 毒(human papillomavirus, HPV)和單純皰疹病毒(herpes simplex virus, HSV)等是容易造成全球流行性疾病的病原體。截止到2016 年,已有90 多種抗病毒藥物被批準用于臨床,表1 列舉了部分常用的抗病毒藥物。這些藥物通過抑制病毒感染過程中的不同階段(包括病毒的滲透、脫殼、合成核酸、將DNA 整合進入宿主的基因組、結(jié)構(gòu)蛋白的表達和組裝、病毒從宿主中釋放以及成熟),以達到抗病毒的效果[12?13]。藥渡公司統(tǒng)計2018年全球抗病毒市場規(guī)模超過550 億美元,其中抗HIV 為300 多億美元,抗肝炎市場為195億美元。突發(fā)高傳染性病毒感染引發(fā)的大流行疾病可造成較高的死亡率,如由2019新型冠狀病毒2019?nCoV(后命名為SARS?CoV?2)引發(fā)的肺炎,截止到2020年5月2日,全球確認感染已超過330 萬,累計死亡超過23 萬例,截止到2020 年8月8 日,全球累計病例已迅速攀升至1946 萬,累積死亡超過72萬例,且病毒的突變率較高易導(dǎo)致耐藥病毒株的出現(xiàn),需要不斷開發(fā)出新的抗病毒藥物。三萜類化合物不僅能夠在病毒復(fù)制早期抑制病毒的吸附和侵入宿主細胞,還可以在病毒侵染細胞后抑制其復(fù)制或成熟的過程,從而能有效保護宿主細胞免受病毒感染[14]。截至目前,尚未有具有抗病毒作用的三萜類藥物上市,只有Bevirimat(編號曾為PA?457、BVM、DSB)、RPR103611、BMS?955176(后來編號為GSK?3532795)、GSK?2838232、MPC?9055(未公布結(jié)構(gòu))、ME3738(圖2)進入到臨床試驗階段,除了GSK?2838232 正處于臨床IIb 期外,其他的幾個均已被終止發(fā)展[6]。本文將對三萜類化合物抗病毒作用的構(gòu)效關(guān)系及其作用機制進行簡要綜述,重點介紹其對艾滋病毒、流感病毒、冠狀病毒和乙肝/丙肝病毒的活性和作用機制,為三萜類抗病毒藥物的設(shè)計和開發(fā)提供參考。

    表1 部分常用于臨床病毒感染治療的藥物Table 1 Some anti-virus drugs commonly used clinically

    圖2 進入到臨床試驗階段的三萜類抗病毒藥物Fig.2 Triterpenoid anti?virus drugs entering clinical trials

    1 三萜抗HIV 的構(gòu)效關(guān)系與作用機制

    圖3 甘草酸及其天然衍生物1和2的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.3 Chemical structures of glycyrrhizic acid and its natural derivatives 1 and 2

    HIV 是一種具有包膜的逆轉(zhuǎn)錄病毒,其病毒顆粒由兩個單鏈RNA 基因組、逆轉(zhuǎn)錄酶(RTase)和整合酶組成。其包膜包含gp120 和gp41 兩種糖蛋白(gp120 和gp41 由前體蛋白gp160 被蛋白酶切割而得),gp41 是跨膜蛋白,gp120 位于表面,它們在病毒傳播過程中與宿主CD4+受體結(jié)合而進入宿主細胞;包膜內(nèi)側(cè)是蛋白p17 形成的球形基質(zhì)以及蛋白p24 形成的錐形衣殼,病毒的基因組和酶處于衣殼內(nèi)部[15]。HIV 主要通過血液和體液傳播,可分為HIV?1 和HIV?2 兩種亞型,HIV?2 的致病性要比HIV?1 低得多,并且其分布范圍受到限制[16]。疫苗的研發(fā)受制于HIV 病毒的變異以及病毒潛伏期等問題,以至于目前仍然沒有有效的HIV 疫苗[17?18]??笻IV藥物的分子靶標涉及HIV生命周期中的許多關(guān)鍵步驟,從病毒吸附宿主細胞開始,細胞蛋白、CD4+和趨化因子受體是HIV 進入細胞的關(guān)鍵因素;與受體結(jié)合后,病毒通過膜融合進入細胞;隨后在細胞中脫殼,并將其RNA 基因組逆轉(zhuǎn)錄為DNA;后續(xù)還有核易位、染色體整合、RNA 轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、病毒裝配、病毒后代出芽和成熟。根據(jù)藥物對HIV 作用部位的不同,可分為:進入階段抑制劑(阻斷HIV 吸附或膜融合)、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、成熟階段抑制劑和雙功能抑制劑五種類型[19?20]。五環(huán)三萜類化合物存在多個位置可用于側(cè)鏈修飾,如C?3、C?17 和C?28,其修飾結(jié)果可使化合物的抗病毒活性和選擇性得到大幅度提高。

    1.1 齊墩果烷型三萜抗HIV 的構(gòu)效關(guān)系與作用機制

    1.1.1 甘草酸及其衍生物 甘草酸(glycyrrhizic acid, GL)(圖3)是甘草根提取物中的主要活性成分,是被檢測到具有抗HIV?1 活性的首批天然糖苷之一,其抗HIV?1 活性的機理與其聚陰離子的結(jié)構(gòu)有關(guān)(甘草酸具有3 個羧基結(jié)構(gòu)),因此可阻斷HIV?1 顆粒與細胞CD4+受體結(jié)合并干擾蛋白激酶C(protein kinases C, PKC:PKC 為HIV?1 顆粒與細胞CD4+受體結(jié)合所必需的酶)的活性來抑制病毒對靶細胞的吸附過程[20?21]。另外,從甘草根中提取分離得到的化合物1 和2(圖3)表現(xiàn)出較好的抗HIV 活性,對HIV 的IC50值 分 別 為29.5 μmol/L 和41.7 μmol/L[22]。

    此外,一些化學(xué)修飾的甘草酸衍生物也是有效的HIV?1 和HIV?2 體外抑制劑,如化合物3 和4(圖4)即是由甘草酸衍生而得,兩者均對HIV 的蛋白p24 表現(xiàn)出一定程度的抑制作用,其中3 的ID50值(抑制50%p24 活性的濃度)為0.35 μmol/L,4 的ID50值為0.09 μmol/L,但是兩者的抗病毒活性均弱于一線藥物疊氮胸苷(疊氮胸苷相應(yīng)的ID50值為0.014 μmol/L)[23]。

    圖4 甘草酸衍生物3和4的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.4 Chemical structures of glycyrrhizic acid derivatives 3 and 4

    1.1.2 齊墩果酸及其衍生物 齊墩果酸(oleanolic acid,OA)(圖5)廣泛分布于木犀科、龍膽科、葫蘆科等植物體內(nèi),具有抗病毒[24]、抗菌[25]、抗腫瘤[26]和抗炎[27]等多種生物活性。從人參根部分離出的齊墩果酸衍生物5(圖5),是第一個含有聚乙炔結(jié)構(gòu)且能夠抑制HIV?1 復(fù)制的三萜類化合物,其IC50值為11.1 μmol/L[28]。表明聚乙炔結(jié)構(gòu)可能能夠促進化合物對于HIV?1 的抑制作用,而具體機制還需進一步研究。

    圖5 齊墩果酸與其天然衍生物5的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.5 Chemical structures of oleanolic acid and its natural derivative 5

    齊墩果酸有三個可供修飾的位點,C?3 位的羥基、C12?C13 位的烯烴和C?28 位的羧基,對不同的位置進行不同的修飾將會不同程度地影響化合物對于HIV?1復(fù)制階段的抑制活性。將C?3位羥基酯化(圖6,化合物6~9),會導(dǎo)致化合物活性下降;將C12?C13 位烯烴還原為烷烴得到化合物10(圖6),其活性較母體增加3 倍;用適當?shù)乃狒?0 的C?3位進行酯化(圖6,化合物11~15),除11 外,其余化合物的活性均有所提升,其中15 的活性最為顯著;將齊墩果酸C?28 位的羧基轉(zhuǎn)化為氨基甲基(圖6,化合物16),然后再在C?3 位羥基和C?28 位氨基同時引入3′,3′?二甲基戊二酸或3′,3′?四亞甲基戊二酸(圖6,化合物17 和18),可使活性增加十倍以上。在6~18 這批化合物中,僅化合物15 的抗病毒活性略優(yōu)于藥物疊氮胸苷,化合物15 的EC50值(抑制50% HIV 復(fù)制所需的濃度)為0.0039 μg/ml,疊氮胸苷的EC50值為0.01 μg/ml,但是化合物15 的細胞毒性卻遠遠高于疊氮胸苷[29]。因此,C12?C13 位的構(gòu)型可能是促使化合物抗HIV 活性提升的關(guān)鍵,另外,對C?3位的羥基和C?28位的羧基進行適當?shù)男揎椧部商嵘衔锏幕钚?。然而,如何能夠降低該類化合物的細胞毒性,還有待探索。

    圖6 化合物6~18的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.6 Chemical structures of compounds 6—18

    圖7 化合物19和20的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.7 Chemical structures of compounds 19 and 20

    另外,對于齊墩果酸C?3位修飾的衍生物,具有3′,3′?二甲基琥珀酸取代基的化合物活性優(yōu)于3′,3′?二甲基戊二酸取代基的化合物[30]。將齊墩果酸C?3 位羥基進行氧化得到3?酮基齊墩果酸(圖7,化合物19),依然維持抗HIV 活性,但是其細胞毒性大幅度增強;用氫氧化鉀對齊墩果酸進行處理,得到齊墩果酸的鉀鹽(圖7,化合物20),具有明顯提升的抗HIV 活性,EC50值(抑制50% HIV 復(fù)制所需的濃度)為0.5 μg/ml[31]。19 和20 的抗HIV 活性雖然較母體有所提升,但是仍劣于藥物疊氮胸苷(疊氮胸苷相應(yīng)的EC50值為0.012 μg/ml),并且細胞毒性遠高于疊氮胸苷。

    1.2 烏蘇烷型三萜抗HIV的構(gòu)效關(guān)系與作用機制

    提取分離自日本路邊青的熊果酸(ursolic acid,UA)和山楂酸(maslinic acid)(圖8)顯示出有效的抑制HIV?1 蛋白酶的活性[32]。Kashiwada 等[33]基于先前對齊墩果酸衍生物的研究經(jīng)驗[31],制備了C?3 位取代的熊果酸衍生物21~28(圖9),研究顯示,除23外,其余衍生物的細胞毒性均弱于母體,而抗HIV的活性無明顯的提升,此現(xiàn)象與齊墩果酸的C?3 位單側(cè)鏈修飾衍生物活性研究類似,即對C?3 位進行單側(cè)鏈修飾對抗HIV 活性無明顯改善[29];另外,熊果酸的鉀鹽(圖9,化合物29)的細胞毒性也明顯增強。未見將C12?C13 烯烴還原或C?3 與C?28 雙側(cè)鏈取代的熊果酸衍生物,無法得知其修飾是否能夠明顯提高化合物抗HIV的活性。

    圖8 熊果酸和山楂酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.8 Chemical structures of ursolic acid and maslinic acid

    1.3 羽扇豆烷型三萜抗HIV 的構(gòu)效關(guān)系與作用機制

    白樺酸(betulinic acid,BA)又名樺木酸(圖10),提取自棒花蒲桃的葉子,是最早被確認為具有抗HIV 活性的羽扇豆烷型五環(huán)三萜類化合物[34]。白樺酸最初被鑒定為抑制HIV?1 復(fù)制的弱抑制劑,而在此基礎(chǔ)上開發(fā)的白樺酸C?3 位的衍生物Bevirimat(PA?457)(圖2)則是一種有效的抗HIV?1 制劑,作用于病毒的成熟階段[35]。已進入到臨床試驗II 期,但是由于病毒結(jié)構(gòu)蛋白對其敏感性降低,于2010年終止研究[6]。對白樺酸的結(jié)構(gòu)修飾主要包括三個方面:C?3 位羥基的修飾(成熟階段抑制劑)、C?28 位羧基的修飾(進入階段抑制劑)以及C?3 位羥基和C?28 位羧基同時修飾(進入及成熟階段雙功能抑制劑)。

    圖9 熊果酸衍生物21~29的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.9 Chemical structures of ursolic acid derivatives 21—29

    圖10 白樺酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.10 Chemical structure of betulinic acid

    Evers 等[36]發(fā)現(xiàn)白樺酸C?3 位羥基對抗HIV 活性的重要性:將構(gòu)型由3β 轉(zhuǎn)變?yōu)?α,差向異構(gòu)導(dǎo)致活性降低至1/10;將3?羥基氧化為3?酮基,活性無明顯變化;而脫水形成2,3?烯烴或3 位引入甲氧基或C?2 位引入羥基都會導(dǎo)致體外活性喪失。然而,Sun 等[37]提出C?3 位酰基側(cè)鏈對活性的提升至關(guān)重要。在白樺酸C?3 位引入3′,3′?二甲基琥珀酸或?;?,可提升其抗HIV?1 活性,其作用機制為干擾了正常的病毒結(jié)構(gòu)蛋白Gag 的加工,從而阻止病毒的成熟過程[38?41]。

    在三萜類化合物的C?28 位羧基進行修飾所得的衍生物,已被證明能夠有效抑制HIV?1 與宿主細胞膜融合的過程[20]。其中,最初報道的白樺酸衍生物RPR103611(圖2)的靶點與HIV?1 跨膜糖蛋白gp41 有關(guān)[42?44]。盡管其在體外顯示出強大的抗病毒活性,但由于體內(nèi)藥效特性較差,Rhone?Poulenc(現(xiàn)為賽諾菲?安萬特)終止了RPR103611 的臨床開發(fā)[45]。

    HIV?1與宿主細胞的融合過程涉及跨膜糖蛋白gp41 的兩個螺旋區(qū)域:一是N 端七肽重復(fù)序列(heptad repeat)HR1(也稱為N 螺旋或N 肽),另一個是C 端七肽重復(fù)序列HR2(也稱為C 螺旋或C 肽)。當病毒與宿主細胞膜融合時,HR1 和HR2 會形成一種具有融合活性的構(gòu)象,稱為“發(fā)夾三聚體(trimer?of?hairpins)”。該結(jié)構(gòu)由三個來自gp41 單體肽的6個α?螺旋束組成,這種結(jié)構(gòu)是許多包膜病毒所共有的結(jié)構(gòu)[46?47]。發(fā)夾三聚體對于病毒與宿主細胞膜融合過程極其重要,因而成為了抗病毒藥物的潛在靶標。Si 等[48]首先以CEM 4 作為宿主細胞,對化合物30 和31(圖11)的HIV?1 病毒侵染細胞的抑制活性進行了鑒定,發(fā)現(xiàn)化合物30 的抑制活性高達95%,化合物31 的抑制活性高達85%。另外,通過光交聯(lián)技術(shù)證明白樺酸衍生物31 的重氮基團能夠與HR2的M626 殘基緊密結(jié)合,同時,模擬對接結(jié)果(圖12)顯示化合物30 和31 與HR2 之間存在多重疏水相互作用,另外,30 和31 側(cè)鏈的3?OH 位于HR2 的極性殘基S649 和Q650 附近,羧基位于由D624、N625 和T627 組成的極性口袋中,證實了HIV 跨膜糖蛋白gp41中的HR2是三萜類化合物的直接靶標。

    對白樺酸的C?3 位羥基和C?28 位羧基同時進行修飾,所得的衍生物32和33(圖13)兼具抑制HIV病毒進入和成熟兩個功能,作用位點分別為膜表面蛋白gp120 和結(jié)構(gòu)蛋白Gag[49];衍生物34~37(圖13)表現(xiàn)出極強的抗HIV?1 活性,其中37 的活性最好,EC50值(抑制50% HIV?1 IIIB 復(fù)制的濃度)為0.006 μmol/L,而藥物疊氮胸苷的EC50值僅為0.056 μmol/L。表明C?28 位側(cè)鏈的原子長度對提高抗病毒效力具有重要意義,同時側(cè)鏈結(jié)構(gòu)含酰胺基團對活性很重要[44,50]。Sun 等[51]在研究白樺酸衍生物IC9564(圖14)時,認為C?3位游離的羥基以及C?28位側(cè)鏈末端游離的羧基是抗HIV活性所必需的,且C?28氨基烷烴側(cè)鏈上亞甲基的數(shù)目對活性至關(guān)重要。

    圖11 白樺酸衍生物30和31的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.11 Chemical structures of betulinic acid derivatives 30 and 31

    圖12 化合物30(a)和31(b)與HR2的對接結(jié)果[48]Fig.12 Docking results of 30(a)and 31(b)with HR2[48]

    圖13 白樺酸C?3,C?28雙取代衍生物32~37的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.13 Chemical structures of betulinic acid C?3,C?28 disubstituted derivatives 32—37

    圖14 白樺酸衍生物IC9564的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.14 Chemical structure of betulinic acid derivative IC9564

    Ren等[52]基于琥珀酸側(cè)鏈的變化,設(shè)計的C?3和C?17雙取代衍生物BMS?955176(后來編號為GSK?3532795)(圖2),是有效的HIV 成熟階段抑制劑,已進入臨床IIb 期試驗。BMS?955176 的結(jié)構(gòu)改造歷程表明白樺酸C?3 和C?17 位的取代基對于獲得具有所需病毒學(xué)和藥代動力學(xué)特征的分子至關(guān)重要[53?55]。另外,基于BMS?955176 的分子結(jié)構(gòu)所開發(fā)的類似物38~63(圖15),其構(gòu)效關(guān)系證實了BMS?955176為抑制HIV?1成熟階段的最佳化合物[56]。但是由于其嚴重的副作用,于2016年終止發(fā)展。

    Qian 等[50]提出白樺酸C?19 位的異丙烯基可能不是活性藥效團,但是對該位置進行適當修飾可以改善藥物的水溶性,進而改善藥物的藥代動力學(xué)性質(zhì);但是在C?30 位引入羥基會導(dǎo)致抗病毒活性降低,表明異丙烯基附近存在氫鍵供體對于活性具有不利影響,這與文獻[36]報道的結(jié)果一致。圖16 為文獻總結(jié)的白樺酸衍生物的抗HIV構(gòu)效關(guān)系。

    Li等[57]認為對白樺酸等天然產(chǎn)物進行修飾是一條提高抗HIV 效力的可行性路徑,但并不是唯一的路徑,還可以通過改變母體結(jié)構(gòu)來改變化合物的活性和生物學(xué)特性,例如將氟原子引入化合物Bevirimat 結(jié)構(gòu)(圖2)中,會影響化合物的親脂性、構(gòu)象柔韌性、代謝穩(wěn)定性等性質(zhì)。氟具有獨特的物理特性,將其摻入分子對藥物設(shè)計非常重要,并且臨床治療中存在許多含氟的藥物[58]。但是在白樺酸衍生物的研究中,將氟引入Bevirimat 的結(jié)構(gòu)中(圖17,化合物64~72),化合物的活性均沒有得到改善[57]?;衔?5 與Bevirimat 的區(qū)別僅在于前者在C?2 位引入氟取代,活性消失表明C?2 位的質(zhì)子可能對抗HIV 活性起關(guān)鍵作用;而化合物68 的抗HIV?1 活性與Bevirimat 相當,表明C?30 位烯丙基的變化對活性無明顯的影響,即C?30的烯丙基可能不是抗HIV活性的關(guān)鍵藥效團,這與文獻[50]報道的研究結(jié)果一致。

    1.4 其他三萜類化合物抗HIV 的構(gòu)效關(guān)系與作用機制

    根據(jù)雜合物的設(shè)計理念,用化學(xué)鍵連接兩種類型的HIV 抑制劑,如HIV?1 逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和HIV?1 蛋白酶抑制劑,兩種酶抑制劑的偶聯(lián)不僅可以降低病毒耐藥性的出現(xiàn)速度,而且可以增強抗HIV的活性。部分三萜類衍生物抗HIV活性較低可能是細胞通透性差所致,因此制備了三萜類與疊氮胸苷的偶聯(lián)物73 ~75(圖18),它們的IC100(完全抑制HIV?1 誘導(dǎo)MT?4 細胞病變的最低濃度)分別為0.589 μmol/L、0.370 μmol/L、0.469 μmol/L,表明可開發(fā)為抗HIV?1制劑[59]。

    圖15 BMS?955176的類似物38~63的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.15 Chemical structures of analogs 38—63 of BMS?955176

    圖16 白樺酸衍生物抗HIV活性的構(gòu)效關(guān)系[50]Fig.16 Structure?activity relationships of betulinic acid derivatives against HIV[50]

    圖17 Bevirimat氟化衍生物64 ~72的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.17 Chemical structures of Bevirimat fluorinated derivatives 64—72

    圖18 三萜類與疊氮胸苷的偶聯(lián)物73 ~75的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.18 Chemical structures of conjugates of triterpenes andazidothymidine 73—75

    以C?3 位為醛基的2,3?開環(huán)三萜(圖19,76 和77)為原料,經(jīng)過格式試劑處理之后氧化得到具有甲基酮結(jié)構(gòu)的化合物78 和79(圖19),79 經(jīng)過堿處理之后得到A 環(huán)中具有α,β?烯腈取代的化合物80(圖19),實驗結(jié)果顯示78 和80 均具有抑制HIV?1體外繁殖的活性,78 的EC50值(抑制50% HIV?1 誘導(dǎo)MT?4 細胞病變所需的濃度)為7.2 μg/ml,80 的EC50值為39.92 μg/ml[60]。

    2 三萜抗流感病毒的構(gòu)效關(guān)系與作用機制

    流感病毒(influenza virus)屬于正粘病毒科,是一種具有多種抗原特性的RNA 病毒,病毒包膜含血凝素蛋白(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA,又稱唾液酸酶)兩種結(jié)構(gòu)蛋白,流感病毒通過其表面的血凝素蛋白,識別和結(jié)合呼吸道表面的唾液酸(sialic acid)受體而引發(fā)感染[61]。作為常見的病原體,流感病毒可通過飛沫傳播,可導(dǎo)致人類和動物嚴重的急性呼吸道感染疾病。流感病毒感染的第一步是由血凝素介導(dǎo)病毒顆粒附著到宿主細胞上,進而與宿主細胞唾液酸受體結(jié)合,導(dǎo)致病毒被內(nèi)吞。神經(jīng)氨酸酶抑制劑(例如奧司他韋和扎那米韋)和M2 離子通道抑制劑(例如金剛烷胺和金剛乙胺)是兩類臨床上用于對抗流感病毒的藥物,可阻止病毒進入細胞[62]。M2蛋白是一個離子通道,允許質(zhì)子穿過,M2離子通道抑制劑則阻斷離子通道活性,并防止病毒RNA 釋放到宿主細胞質(zhì)中[63];神經(jīng)氨酸酶抑制劑靶向神經(jīng)氨酸酶蛋白,抑制其活性,并導(dǎo)致子代病毒無法從宿主細胞中脫離[64]。目前,已經(jīng)識別出四種類型的流感病毒,即甲、乙、丙和丁型流感病毒,其中甲型流感跨多物種傳播且易突變,分為16 個HA 和9 個NA亞型,危害最大。

    2.1 齊墩果烷型三萜抗流感病毒的構(gòu)效關(guān)系與作用機制

    2.1.1 甘草酸及其衍生物 甘草酸顯示出廣泛的抗病毒譜,在對其抑制流感病毒的機制的研究中,發(fā)現(xiàn)其可以與細胞膜相互作用,從而阻止病毒被內(nèi)吞[65]。從甘草根部提取分離得到的化合物81 ~84(圖20)對H1N1 流感病毒表現(xiàn)出良好的抑制活性,其IC50值與藥物磷酸奧司他韋相當[22]。此外,甘草酸衍生的85 ~88(圖21)均表現(xiàn)出有效的抗流感活性,其體外活性較一線藥物金剛烷胺高出十倍以上[66],表明甘草酸衍生物具有開發(fā)成為抗流感病毒制劑的潛力。

    圖19 化合物76~80的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.19 Chemical structures of compounds 76—80

    圖20 天然產(chǎn)物81 ~84的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.20 Chemical structures of natural products 81—84

    唾液酸存在于各種動物組織的糖蛋白和糖脂的糖鏈末端,因其具有抗病毒等多種生物活性,并且唾液酸?雙黃酮類共軛物具有抗病毒活性,而被應(yīng)用到三萜衍生物的研究中。甘草酸衍生物與唾液酸的綴合物(圖22,89和90)和齊墩果酸衍生物與唾液酸的綴合物(圖22,91和92)均顯示出對流感病毒結(jié)構(gòu)蛋白NA 的抑制活性,并且對流感病毒的增殖有明顯的抑制作用[67]。

    環(huán)糊精(cyclodextrin,CD)是一類高度水溶性和生物相容性的環(huán)狀寡糖,與三萜類化合物綴合可改善三萜化合物的水溶性,以增強其生物利用度。其中甘草次酸與環(huán)糊精的綴合物93 ~98(圖23)具有良好的抗病毒活性的同時,均較其母體表現(xiàn)出更高的水溶性和更低的細胞毒性[68]。

    圖21 甘草酸衍生物85 ~88的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.21 Chemical structures of glycyrrhizin derivatives 85—88

    圖22 三萜與唾液酸綴合物89 ~92的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.22 Chemical structures of the conjugates 89—92 of triterpene and sialic acid

    2.1.2 齊墩果酸及其衍生物 已知神經(jīng)氨酸酶抑制劑和M2 離子通道抑制劑分別通過抑制結(jié)構(gòu)蛋白NA 和離子通道達到阻止病毒進入細胞的效果[62]。然而,耐藥性流感病毒的出現(xiàn)限制了這些藥物的使用。為了尋找新型的抗病毒藥物,研究者們對三萜類藥物進行抗病毒療效研究。Yu 等[69]通過分別測定在不同的時間里、在添加化合物99(圖24)的條件下,流感病毒核衣殼蛋白在感染細胞中的表達水平,以此初步判斷藥物的作用階段。結(jié)果表明,化合物99 的抗病毒活性僅在病毒發(fā)展周期的早期有效,因此推測該化合物作用于病毒附著或與宿主細胞融合階段?;诹鞲胁《緜鞑ジ腥镜牡谝徊绞墙Y(jié)構(gòu)蛋白HA 與宿主細胞唾液酸受體結(jié)合,因此研究者們將化合物的作用靶標鎖定為結(jié)構(gòu)蛋白HA,以破壞HA 與唾液酸受體的結(jié)合過程,有效阻止流感病毒進入宿主細胞[69?76]。血凝抑制(HI)、表面等離子共振(surface plasmon resonance,SPR)和分子對接等實驗結(jié)果表明,化合物99(圖25)[69]、100(圖26)[70]、101(圖27 和圖28)[71]、102(圖29 和圖30)[72]、103 ~108(圖31 和圖32)[73]等化合物能夠與病毒包膜結(jié)構(gòu)蛋白HA 緊密結(jié)合,破壞HA 與唾液酸受體的相互作用,從而破壞病毒與宿主細胞的結(jié)合,達到抗病毒效果,其體外抗病毒效果與一線藥物奧司他韋相當。為了評價化合物99 在體內(nèi)的抗流感病毒作用,Yu 等[69]通過對感染A/WSN/33 流感病毒的小鼠進行給藥實驗,發(fā)現(xiàn)化合物99 對病毒的感染狀況有改善作用,且其治療效果呈現(xiàn)劑量依賴性。此外,與未經(jīng)藥物處理的小鼠相比,化合物99 處理的感染小鼠死亡率明顯下降,表明化合物99 可以在體內(nèi)保護小鼠免受流感病毒的感染。以上研究證明了三萜類化合物可以作為抗流感病毒的新型先導(dǎo)化合物。

    圖23 甘草次酸與環(huán)糊精的綴合物93 ~98的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.23 Chemical structures of the conjugates 93—98 of glycyrrhetinic acid and cyclodextrin

    圖24 化合物99的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.24 Chemical structure of compound 99

    流感病毒與宿主細胞膜的融合過程與HIV 一樣,同樣涉及蛋白HA 的HR1 和HR2 兩個α?螺旋區(qū)域。光交聯(lián)反應(yīng)結(jié)果顯示,化合物109(圖33)能夠與HR2 區(qū)域中N471 和I476 之間的殘基緊密結(jié)合;同時,模擬對接實驗結(jié)果(圖34)顯示,109與HR2之間存在多重疏水相互作用,且109 側(cè)鏈的重氮基團與HR2 的殘基N472 之間形成氫鍵[48]。這兩個實驗說明HR2 是三萜類化合物抑制流感病毒與宿主膜融合的直接靶標。

    研究[77]表明,具有三糖配基的化合物110(圖35)對H5N1 流感病毒進入宿主細胞的過程表現(xiàn)出良好的抑制活性,其IC50值為7.2~8.0 μmol/L,進一步的分析研究表明,三糖配基對于110 的活性至關(guān)重要[74,78?79]。同樣具有三糖配基的化合物111(圖35)與HA 的 分 子 對 接 顯 示,111 與HA 的Lys26、Asn27、Asn50、Asn53四個氨基酸殘基形成比較強的氫鍵作用(圖36),且分子對接結(jié)果與111 對HA 的抑制活性實驗結(jié)果具有一致性,表明該類化合物的作用靶點可能為蛋白HA[74]。

    為了進一步探究三糖配基與三萜化合物的構(gòu)效關(guān)系,選取齊墩果酸為母體,固定C?3位為三糖配基,改變?nèi)乒羌芑驅(qū)?17 進行不同側(cè)鏈修飾(圖37,化合物112 ~124),表明C?28 位的C O 基團對維持活性的重要性(113 vs 120),對該位置羧酸進行酯化或酰胺化修飾有利于提升抗病毒活性,同時降低細胞毒性;另外,異構(gòu)的3?α構(gòu)型有利于降低化合物的細胞毒性(113 vs 122),而三萜的結(jié)構(gòu)骨架對抗H5N1 流感病毒活性沒有顯著影響(123 vs 124),揭示了結(jié)構(gòu)修飾對抗病毒活性的重要性[75]。此外,化合物118 與HA 的模擬對接結(jié)果與文獻[74]報道化合物111 的結(jié)果具有一致性,更加證實了C?3 多糖取代對提升抗病毒活性的重要性。

    圖25 化合物99與HA的對接結(jié)果[69](圖中顯示,99占據(jù)唾液酸受體的保守結(jié)合口袋,并且99的C?3?羥基與殘基Arg133、Lys156形成氫鍵;99的β?糖基部分的2′?羰基與Ala137、Gln226形成氫鍵,β?糖基部分的3′?羰基與Ser145形成氫鍵。另外,在99及其結(jié)合口袋之間存在多重疏水相互作用,即與殘基Val155、His183、Ser193、Pro185、Tyr95、Pro186、Asp190、Trp53、Thr136、Val135和Leu194之間存在疏水相互作用)(ACS出版社授權(quán)使用)Fig.25 Docking results of compound 99 with HA[69](It shows that 99 occupies the conserved pocket of sialic acid receptor,and the 3?OH of 99 forms hydrogen bond with the residues Arg133 and Lys156;the 2′?carbonyl of the β?galactose moiety of 99 forms hydrogen bond with Ala137 and Gln226,and the 3′?carbonyl of the β?galactose moiety forms hydrogen bond with Ser145.In addition,there exist hydrophobic interactions between 99 and residues Val155,His183,Ser193,Pro185,Tyr95,Pro186,Asp190,Trp53,Thr136,Val135 and Leu194)(With the permission of ACS Press)

    圖26 化合物100的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.26 Chemical structure of compound 100

    圖27 化合物101的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.27 Chemical structure of compound 101

    圖28 化合物101與HA的對接結(jié)果[71](101的C?3位羥基與Gly225形成氫鍵,糖基部分的2′?羥基和3′?羥基也分別與Arg133、賴氨酸Lys156和Gly158形成氫鍵;C?28位的羰基和糖基的6′?羥基與Ser193形成氫鍵。此外,三氮唑部分與Val155和Leu194之間存在堆積相互作用)Fig.28 Docking results of compound 101 with HA[71](The 3?OH of 101 forms hydrogen bond with the residues Gly225,and the 2′?OH and 3′?OH of the glycosyl moiety also form hydrogen bond with Arg133,Lys156,and Gly158;the carbonyl at C?28 of 101 and 6′?OH of glycosyl moiety form hydrogen bond with Ser193.In addition,there is a stacking interaction between the triazole portion and Val155 and Leu194)

    圖29 化合物102的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.29 Chemical structure of compound 102

    為了了解三萜C?3位多糖配基的類型、構(gòu)型、鏈長度以及糖鍵和化合物抗病毒活性之間的相關(guān)性,設(shè)計了化合物125~134(圖38)[76]。其構(gòu)效關(guān)系表明葡萄糖上C?2′和C?4′羥基上的取代基對抗病毒效力具有重要作用(125 vs 126,127,128,129);取代基處于葡萄糖C?2′或C?4′,對活性也會產(chǎn)生極大的影響(133 vs 134);三萜的結(jié)構(gòu)骨架對抗H5N1 流感病毒活性沒有顯著影響(130 vs 132),這與先前文獻[75]的研究結(jié)果一致。

    為了改善三萜類化合物的水溶性,設(shè)計了環(huán)糊精與三萜的綴合物。所有綴合物的水溶性均得到改善,化合物135 ~137(圖39)對甲型H1N1 流感病毒有較強的抑制活性,并且與蛋白HA 具有較高的親和力[80?81]。

    2.2 羽扇豆烷型三萜抗流感病毒的構(gòu)效關(guān)系與作用機制

    從棗樹(Zizyphus jujuba Mill)分離得到的白樺酸已被證明可通過抗血栓形成而抑制流感病毒的感染[82]。從日本榿木(Alnus japonica)樹皮中提取分離的成分138(圖40)對流感病毒表現(xiàn)出明顯的抑制作用,其 對 流 感 病 毒KBNP?0028 的EC50值 為12.5 μmol/L,遺憾的是,細胞毒性較大[83]。從活性角度考慮,該化合物有發(fā)展成為抗病毒藥物的潛力,但是還需進一步優(yōu)化以降低其對細胞的毒性作用。

    圖30 化合物102與HA的對接結(jié)果[72](102的3?羥基與Ser193形成氫鍵,側(cè)鏈部分與Gln226和Ala137形成氫鍵。另外,102與結(jié)合口袋中的Lys156、Leu194、Trp153、Ser145、Val135、Thr136、Tyr95、Arg133、Val155殘基存在疏水相互作用)Fig.30 Docking results of compound 102 with HA[72](The 3?OH of 102 forms hydrogen bond with Ser193,and the sidechain forms hydrogen bond with Gln226 and Ala137.In addition,there exist hydrophobic interactions between 102 and the pocket formed by Lys156,Leu194,Trp153,Ser145,Val135,Thr136,Tyr95,Arg133,and Val155)

    由白樺酸衍生而來的化合物139(圖41)具有顯著的抗流感病毒活性,其EC50值(抑制50%流感病毒誘導(dǎo)MDCK 細胞病變的濃度)較藥物磷酸奧司他韋的更低(磷酸奧司他韋相應(yīng)的EC50值為12.5 μmol/L)。139 與HA 的對接結(jié)果(圖42)顯示,139 的C?3位羥基與Lys222 形成氫鍵,C?17 位羰基與His180形成氫鍵,而側(cè)鏈部分與HA 之間存在氫鍵相互作用、π?π 堆積相互作用、疏水相互作用,極大地增強了化合物與HA 之間的結(jié)合力,這也解釋了為什么該化合物的活性較高的內(nèi)在原因[84]。

    3 三萜抗冠狀病毒的構(gòu)效關(guān)系與作用機制

    冠狀病毒是一種具有包膜的正鏈RNA 病毒,其包膜包含膜糖蛋白(membrane glycoprotein, M)、包膜蛋白(envelope protein, E)和棘突糖蛋白(spike glycoprotein,S)。冠狀病毒基因組RNA 可被翻譯產(chǎn)生兩個復(fù)制酶多蛋白,稱為pp1a和pp1ab,其中pp1a包含一個木瓜樣蛋白酶(papain?like protease,PLpro)和 一 個 小 RNA 病 毒 3C 樣 蛋 白 酶(picornavirus 3C?like protease, 3CLpro,也稱主要蛋白酶或Mpro),3CL 蛋白酶和PL 蛋白酶對病毒的復(fù)制必不可少[85]。

    圖31 化合物103 ~108的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.31 Chemical structures of compounds 103—108

    圖32 化合物106與HA的對接結(jié)果[73](106的3?羥基與Gln226形成氫鍵,側(cè)鏈部分與Lys156和Gly158形成氫鍵)Fig.32 Docking results of compound 106 with HA[73](The 3?OH of 106 forms a hydrogen bond with Gln226,and the sidechain forms hydrogen bond with Lys156 and Gly158)

    圖33 化合物109的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.33 Chemical structure of compound 109

    圖34 化合物109與HR2的模擬對接結(jié)果[48]Fig.34 Docking results of 109 with HR2[48]

    2019新型冠狀病毒(2019?nCoV,引發(fā)新型冠狀病毒肺炎COVID?19)是目前已知的第7種可以感染人的冠狀病毒,其余6 種分別是HCoV?229E、HCoV?OC43、HCoV?NL63、HCoV?HKU1、SARS?CoV(引發(fā)重癥急性呼吸綜合征)和MERS?CoV(引發(fā)中東呼吸綜合征)。2019年12月以來新型冠狀病毒肺炎造成全球健康威脅,到目前為止,只有較少的治療方法和藥物被開發(fā)出來,如干擾素和甘草酸。甘草酸是首批在體外發(fā)現(xiàn)對SARS?CoV 有活性的化合物之一,Cinatl等[86]首先報道了甘草酸及其衍生物具有抗SARS?CoV 活性,其不僅可以抑制病毒復(fù)制過程,還能在病毒生命周期的開始階段抑制病毒的吸附和滲透。曹敏杰等[87]采用RT?PCR 和Western blot 技術(shù),證明了甘草酸可有效抑制豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)的復(fù)制過程。

    圖35 化合物110和111的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.35 Chemical structures of compounds 110 and 111

    圖36 化合物111與HA的分子對接結(jié)果[74]Fig.36 Docking results of compound 111 with HA[74]

    3.1 齊墩果烷型三萜抗冠狀病毒的構(gòu)效關(guān)系與作用機制

    Wu 等[88]為了鑒定50 種化合物(包括天然產(chǎn)物和合成化合物)是否具有有效的抗SARS 活性,檢測了它們對SARS?3CL蛋白酶和病毒進入階段的抑制活性,發(fā)現(xiàn)其中的化合物140 和141(圖43)在小于100 μmol/L 的濃度下對SARS?3CL 蛋白酶表現(xiàn)出抑制作用。

    為了搜尋更有效的抗SARS?CoV 的化合物,設(shè)計了甘草酸的衍生物142 ~156(圖44)[89]。構(gòu)效關(guān)系顯示,引入2?乙酰胺基?β?D?吡喃葡萄糖胺(化合物142)能大幅度增加其抗病毒活性,部分原因在于引入糖胺可增強化合物的水溶性,另一部分是由于冠狀病毒表面蛋白具有高度糖基化的特點,引入糖胺可增強化合物與病毒糖蛋白之間的相互作用。化合物150和152的活性分別較母體提高了45倍和70 倍,具有開發(fā)潛力,但細胞毒性較高,大大降低了治療的安全性;155 和156 的共同特征在于甘草酸C?3 位的糖基被官能團取代,同時C?30 位的羧基被甲酯化,兩者均未顯示抗SARS?CoV 的活性。說明合理修飾甘草酸可得到更具潛力的抗SARS 冠狀病毒衍生物,但是細胞毒性方面也會受到影響,所以要在綜合考慮結(jié)構(gòu)修飾和藥效的前提下,對甘草酸進行合理改造。

    3.2 其他三萜類化合物抗冠狀病毒的構(gòu)效關(guān)系與作用機制

    化合物157 ~178(圖45)是提取自桐葉的天然產(chǎn)物,其中化合物159, 160, 163, 165 ~167, 170 ~172,175 ~178 均對人類冠狀病毒HCoV?229E 具有顯著的抑制活性,這些結(jié)構(gòu)為開發(fā)有效的抗HCoV藥物提供了參考[90]。

    提取自雷公藤的化合物179 ~182,并利用鈀碳將179 還原得到183(圖46),5 個化合物均對SARS?CoV 3CL 蛋白酶具有顯著的抑制活性,另外,分子對接結(jié)果顯示,182 C?3 位的羥基可與SARS?CoV 3CL 蛋白酶Cys 44、Cys 44 的羰基的氧原子和Thr 25 的羥基形成氫鍵(圖47),而183 除了疏水相互作用外,沒有與酶發(fā)生任何鍵間的相互作用,揭示了C?20 位的甲基對整體構(gòu)型的影響以及在抑制SARS?CoV 3CL 蛋白酶活性方面的重要作用[91]。這為更深入地研究三萜對于病毒的作用機制提供了參考。

    4 三萜抗HBV/HCV 的構(gòu)效關(guān)系與作用機制

    乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)兩種病毒都是血源性的,可以通過性接觸、從母親到胎兒的垂直傳播以及通過共用針頭和輸血傳播。

    圖37 化合物112 ~124的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.37 Chemical structures of compounds 112—124

    4.1 三萜抗HBV的構(gòu)效關(guān)系與作用機制

    HBV 是一種小型的、具有包膜的雙鏈DNA 病毒,可引起急性和慢性肝炎以及肝硬化。HBV 基因組具有四個開放閱讀框(ORF),分別編碼x 蛋白、DNA 聚合酶、核心蛋白(包含核心抗原HBcAg 和e抗原HBeAg,HBeAg 埋藏于HBcAg 內(nèi)部)和表面蛋白(HBsAg),其中HBsAg 由?。⊿HBs)、中(MHBs)和大(LHBs)三個蛋白組成[92]。HBV 感染的唯一靶標是肝臟細胞,其受體為膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白,即鈉牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)[93]。盡管乙型肝炎疫苗的引入已在全球范圍內(nèi)降低了乙型肝炎病毒(HBV)攜帶者的患病率,但是治療被慢性HBV 感染的兒童仍然是一個挑戰(zhàn)。FDA 批準了幾種HBV 抑制劑,如拉米夫定(lamivudine)和阿德福韋(adefovir),然而,嚴重的副作用和耐藥性導(dǎo)致該藥物的臨床應(yīng)用受到限制[94],因此,亟需尋找具有新型抗病毒靶標和機制的抗HBV藥物。

    4.1.1 齊墩果烷型三萜抗HBV 的構(gòu)效關(guān)系與作用機制 甘草酸已用于治療慢性HBV 感染多年,通過抑制HBV的HBsAg的分泌而發(fā)揮抑制作用[95?96]。此外,甘草次酸(glycyrrhetic acid,GA)(圖48)已被用作肝靶向藥物的配體,并且甘草次酸修飾的載體被證明對肝或肝細胞的靶向遞送更為有效[97?98]?;谏鲜鼋Y(jié)論,Wang 等[99]研究了一系列甘草次酸衍生物對HBV 的抑制活性,其中化合物184 ~187(圖49)對HBV 的DNA 復(fù)制階段表現(xiàn)出明顯的抑制作用。特別值得指出的是,化合物187 對于HBV 表面蛋白的抑制能力遠強于藥物替諾福韋。其構(gòu)效關(guān)系如圖50所示。

    圖38 化合物125 ~134的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.38 Chemical structures of compounds 125—134

    圖39 三萜與環(huán)糊精綴合物135 ~137的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.39 Chemical structures of conjugates 135—137 of triterpene and cyclodextrin

    圖40 天然產(chǎn)物138的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.40 Chemical structure of natural product 138

    4.1.2 羽扇豆烷型三萜抗HBV 的構(gòu)效關(guān)系與作用機制 天然白樺酸及其衍生物已被證明具有良好的抗病毒活性[18]。Yao 等[100]通過轉(zhuǎn)基因小鼠實驗證明,在感染HBV 的轉(zhuǎn)基因小鼠的肝細胞中,白樺酸可以抑制含錳超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD2)的表達來顯著抑制HBV 的復(fù)制過程,并且SOD2 的敲低可模仿該抑制作用,而SOD2的過表達則可消除該抑制作用。表明白樺酸介導(dǎo)的HBV 清除是由于線粒體氧化還原平衡的調(diào)節(jié)所致。SOD2 是位于線粒體中的一種抗氧化酶,可清除超氧陰離子(O2?),避免形成過氧化氫,抑制SOD2表達則導(dǎo)致線粒體中活性氧(ROS)的過度生成,繼而可能觸發(fā)線粒體功能障礙和細胞凋亡。

    圖41 化合物139的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.41 Chemical structure of compound 139

    圖42 化合物139與HA的對接結(jié)果[84]Fig.42 Docking results of compound 139 with HA[84]

    圖43 化合物140和141的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.43 Chemical structures of compounds 139 and 140

    圖44 甘草酸衍生物142 ~156的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.44 Chemical structures of glycyrrhizic acid derivatives 142—156

    圖45 提取自桐葉的天然產(chǎn)物157 ~178的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.45 Chemical structures of natural products 157—178 extracted from the leaves of Euphorbia neriifolia

    圖46 化合物179 ~183的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.46 Chemical structures of compounds 179—183

    圖47 化合物182與SARS?CoV 3CL蛋白酶的對接結(jié)果[91]Fig.47 Docking results of compound 182 with SARS?CoV 3CL protease[91]

    圖48 甘草次酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.48 Chemical structure of glycyrrhetinic acid

    圖49 甘草次酸衍生物184 ~187的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其抗HBV活性Fig.49 Chemical structures and anti?HBV activity of glycyrrhetinic acid derivatives 184—187

    4.1.3 其他三萜抗HBV的構(gòu)效關(guān)系與作用機制提取自西藏蕨麻的天然產(chǎn)物188(圖51),被證明可降低細胞中HBV 蛋白HBsAg 和HBeAg 的表達水平,以 及 抑 制HBV 的DNA 復(fù) 制[101]。Li 等[102]合 成 了一系列A 環(huán)2,3?開環(huán)或3,4?內(nèi)酯的三萜類衍生物(圖52,化合物189 ~204),其中190、193、195、198、201、203和204對HBV 蛋白HBsAg和HBeAg的分泌顯示出較好的抑制作用;具有C12/C13 雙鍵的193、194、201 和204 的活性比無雙鍵的198、199、202 和203要高,說明C12/C13雙鍵對于維持活性起重要作用;此外,3,4?內(nèi)酯的水解產(chǎn)物191、194、199 對HBV的DNA 復(fù)制的抑制作用略高于190、193、198,表明A 環(huán)裂解成游離酸可適當提升化合物對HBV 的DNA復(fù)制的抑制活性。

    4.2 三萜抗HCV的構(gòu)效關(guān)系與作用機制

    HCV 是黃病毒科中的一種具有包膜的正鏈RNA 病毒,其基因組由5個非翻譯區(qū)(UTR)、一個開放閱讀框和一個短鏈3′UTR 組成,其中5 個UTR 序列對于病毒的復(fù)制必不可少[103]。開放閱讀框編碼一種多聚蛋白,該蛋白可被宿主和病毒蛋白酶加工成至少10 種成熟病毒蛋白,其順序依次為NH2-CE1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH,其中E1和E2是核心結(jié)構(gòu)蛋白,NS5B是一種RNA依賴性RNA 聚合酶(RdRp),E1、E2 和RdRp 是新型抗病毒化合物的有效分子靶標[104]。HCV 是一種血液病毒,隨著血液循環(huán)流經(jīng)肝臟時,能特異性地識別肝細胞表面的CD81 受體和一些待確定的輔助受體,從而選擇性感染肝細胞,它是導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化的主要原因,并最終可導(dǎo)致肝癌[105]。利巴韋林(ribavirin)和聚乙二醇干擾素(pegylated interferon alpha,PEG?IFN?α)聯(lián)合使用是一種治療HCV 感染的標準方法,但是由于其帶來的副作用使得75%的患者無明顯療效[106]。最近批準的靶向HCV 復(fù)制階段的特拉匹韋(telaprevir)和波普瑞韋(boceprevir)代表了控制HCV 感染的新時代的開始。但是,由于病毒對藥物的耐藥性,因此仍然亟需找到新型的抗HCV候選藥物。

    圖50 甘草次酸衍生物抗HBV的構(gòu)效關(guān)系Fig.50 Structure?activity relationships of glycyrrhetinic acid derivatives against HBV

    圖51 天然產(chǎn)物188的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.51 Chemical structure of natural product 188

    圖52 A環(huán)為2,3?開環(huán)或3,4?內(nèi)酯的五環(huán)三萜類衍生物189 ~204的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.52 Chemical structures of triterpene derivatives 189—204 with seco?A?or 3,4?lactone pentacyclic triterpenoids

    4.2.1 甘草酸及其衍生物 提取自甘草干根的甘草酸已被證明能夠有效抑制HCV 核心蛋白的表達,且與干擾素具有協(xié)同作用,另外,還可減輕由于HCV 引起的肝脂肪變性[107?108]。Matsumoto等[109]已明確甘草酸抑制HCV 的作用機制,即通過抑制具有感染性HCV 顆粒的釋放而達到抗病毒效果。大豆皂醇A(soyasapogenol A)(圖53)的衍生物ME3738(圖2)可抑制HCV 的復(fù)制,并與干擾素具有協(xié)同作用,表明ME3738 和干擾素的組合可能對慢性丙型肝炎患者有治療作用[110?111]。

    圖53 大豆皂醇A的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.53 Chemical structure of soyasapogenol A

    圖54 化合物205 ~211的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.54 Chemical structures of compounds 205—211

    4.2.2 齊墩果酸及其衍生物 據(jù)報道,中草藥女貞子的水提取物具有直接抑制HCV RdRp 的活性[112]。進一步的分析研究表明,該提取物的兩種抗病毒成分為齊墩果酸和熊果酸,兩者均可部分地抑制HCV RdRp的活性而達到抗HCV效果[24]。Ma等[113]制備了一系列齊墩果酸衍生物,其中205 ~211(圖54)對HCV 蛋白酶具有顯著的抑制作用,其構(gòu)效關(guān)系如圖55所示,該構(gòu)效關(guān)系對進一步設(shè)計和合成作為HCV候選藥物的三萜衍生物具有參考意義。

    圖55 齊墩果酸衍生物抗HCV的構(gòu)效關(guān)系Fig.55 Structure?activity relationships of oleanolic acid derivatives against HCV

    圖56 刺囊酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.56 Chemical structure of echinocystic acid

    Yu 等[114?115]的 研 究 顯 示,齊 墩 果 酸 和 刺 囊 酸(echinocystic acid,EA)(圖56)的衍生物(圖57,化合物212 ~227)均表現(xiàn)出良好的抑制HCV進入宿主細胞的活性,它們主要靶點為HCV結(jié)構(gòu)蛋白E2,通過與E2結(jié)合而中斷E2與其受體CD81之間的相互作用,進而阻斷了病毒和宿主細胞的識別過程;此外,此研究還表明刺囊酸的A和B環(huán),以及C、E環(huán)的左側(cè)結(jié)構(gòu)是高度保守的,即對其進行修飾或改造,會對抗病毒活性有不利影響,而對D環(huán)進行合理修飾可提高抗病毒活性,并由此推定了刺囊酸及其衍生物抑制HCV進入宿主細胞的作用機制(圖58)。Wang等[116]通過開環(huán)或擴環(huán)實驗進一步證明了以上結(jié)論。

    然而,HCV 結(jié)構(gòu)蛋白與其受體CD81 之間存在至少兩個口袋,對于刺囊酸這樣的小分子很難通過競爭作用來占據(jù)口袋,因此在進一步研究中,Yu等[114,117]試圖將多個刺囊酸分子偶聯(lián)在一起,以增強藥效。通過對連接子進行一系列改進和優(yōu)化,得到的二聚物228 ~232(圖59)具有較好的抗HCV 活性,其中化合物228 和231 最具潛力。另外,刺囊酸二聚體的刺囊酸部分高度保守,任何修飾或取代都可能顯著降低甚至消除其抗HCV活性[118]。

    圖57 齊墩果酸與刺囊酸衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)(212 ~224為齊墩果酸的衍生物,225 ~227為刺囊酸的衍生物)Fig.57 Chemical structures of oleanolic acid derivatives and echinocystic acid derivatives(212—224 are oleanolic acid derivatives,225—227 are echinocystic acid derivatives)

    圖58 推定的刺囊酸及其衍生物抗HCV的作用機制[114](經(jīng)ACS出版社授權(quán))Fig.58 A proposed mechanism for echinocystic acid and its derivatives against HCV[114](With the permission of ACS Press)

    即便三萜類化合物可有效抑制HCV 進入宿主細胞,但還是存在水溶性較低的問題,這將導(dǎo)致該類藥物的生物利用度低。而將三萜與環(huán)糊精偶聯(lián)所得的綴合物233 ~252(圖60),其水溶性得到改善,并且大部分可維持或提高其抗HCV 活性。最具潛力的化合物248 和251,平均IC50值(抑制50%HCV 復(fù)制所需的濃度)分別為1.18 μmol/L 和0.25 μmol/L,并且在濃度為100 μmol/L時,未觀察到其對細胞產(chǎn)生的毒性作用[119?120]。此研究為開發(fā)三萜類綴合物作為HCV 進入階段的抑制劑提供了理論依據(jù)。

    5 結(jié)論與展望

    圖59 化合物228 ~232的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.59 Chemical structures of compounds 228—232

    圖60 三萜與環(huán)糊精的綴合物233 ~252的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.60 Chemical structures of conjugates 233—252 of triterpene and cyclodextrin

    研究表明許多天然三萜及其衍生物除具有抗HIV、流感病毒、冠狀病毒、HBV/HCV 活性外,對抗單純皰疹病毒[121?123]、人呼吸道合胞病毒[124?125]、寨卡病毒[126]、乳頭狀瘤病毒[127?128]等病毒也具有抑制活性。三萜骨架目前主要靠植物萃取分離來獲取,來源受到限制,三萜在預(yù)防和治療病毒性疾病中的價值尚未被完全開發(fā),只有極少數(shù)三萜化合物進入到IIb 期臨床試驗。由于對抑制劑的確切靶標和作用機制尚不明確,同時很多化合物水溶性較差,所以限制了它們的成藥性。因此仍然需要投入大量的時間和精力對其進行更加深入的探索,包括:(1)借助合成生物學(xué)和計算機虛擬篩選技術(shù)發(fā)掘更多的三萜骨架結(jié)構(gòu),并解決科學(xué)研究的先導(dǎo)化合物和工業(yè)生產(chǎn)的原料藥的來源問題;(2)借助有機化學(xué)和藥學(xué)闡明構(gòu)效關(guān)系和作用靶標,以期基于生物大分子結(jié)構(gòu)或者藥效團模型合理設(shè)計出具有高效抗病毒活性制劑,同時通過結(jié)構(gòu)修飾增強此類化合物與靶標的結(jié)合力,以及改善其成藥性,如引入合適的非天然氨基酸或含有酰胺基團的小分子。

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