lncRNA MIAT在巨噬細胞炎癥反應中的作用①

王子葉 楊 堃 溫大蔚 趙 磊 王吉波

(青島大學附屬醫(yī)院風濕免疫科，青島 216000)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜關節(jié)慢性炎癥為主要臨床表現(xiàn)的系統(tǒng)性疾病[1]。近年研究提出巨噬細胞為RA病理生理核心炎癥細胞，涉及RA的各個階段，尤其是RA早期。巨噬細胞激活后產生大量炎癥細胞因子和趨化因子如腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factorα,TNF-α)和IL-1β，導致RA炎癥過程[2]。對巨噬細胞炎癥反應機制的探討有助于進一步明確RA發(fā)病機制，探索新的治療靶點。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是長度在200 bp以上，不具備編碼蛋白功能的RNA[3]。許多證據(jù)表明lncRNAs參與機體的多種生物過程，包括炎癥反應[4]。近年lncRNAs在風濕免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、RA中的作用也引起眾多關注[3，5-7]。lncRNA 心肌梗死相關轉錄本(lncRNA myocardial infarction associated transcript，lncRNA MIAT)是一種主要表達于心肌細胞和腎臟細胞、具有調控蛋白合成功能的lncRNA。Fagerberg等[8]利用芯片技術對人體組織和器官進行轉錄組學分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA MIAT在骨髓中高表達，說明骨髓是lncRNA MIAT的主要作用場所之一。此外，lncRNA MIAT在多種疾病的發(fā)生中扮演重要角色，主要與炎癥反應的激活相關[9]。骨髓內以單核巨噬細胞為主的炎癥細胞浸潤增加導致的骨髓水腫被認為是RA的早期主要病理表現(xiàn)之一，且長期持續(xù)存在于RA各階段[10]。因而推測lncRNA MIAT可能與骨髓巨噬細胞的炎癥反應有關進而影響RA發(fā)病。本文旨在研究lncRNA MIAT在小鼠巨噬細胞J774A.1中的作用及其可能作用的炎癥通路，為進一步探究lncRNA MIAT在RA骨髓巨噬細胞炎癥反應中的機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠來源巨噬細胞J774A.1(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)；DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone，美國)；胎牛血清(fatal bovine serun,FBS;Gibco,美國);脂多糖(lipopolysaccharide,LPS;Sigma，美國)；ERK5特異性抑制劑ERK5-IN-2(MCE，美國)；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO；索萊寶，北京)；shNC/MIAT 質粒(吉瑪基因，上海)；TRIzol，real time-qPCR試劑盒(TaKaRa，大連)；引物(華大基因，深圳)；核質分離試劑盒(Invitrogen，美國)；PVDF膜(Millipore，德國)；BCA試劑盒(碧云天，中國)；RIPA(10X)、蛋白酶抑制劑Cocktail、GAPDH、NF-κB、ERK1/2、ERK5、STAT3、磷酸化-NF-κB、磷酸化-ERK1/2、磷酸化-ERK5、磷酸化-STAT3一抗和HRP-山羊抗兔二抗(CST，美國)；ECL發(fā)光液(Thermo Scientific，美國)；小鼠來源IL-1β、TNF-αELISA試劑盒(eBioscience，美國)；LightCyclerTM480 Ⅱ qPCR儀(Roche，瑞士)；電泳轉膜設備、顯影儀、熒光酶標儀(Bio-Rad，美國)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及炎癥反應細胞模型的制備 含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液用于培養(yǎng)小鼠來源巨噬細胞J774A.1，細胞密度達80%～90%時傳代，傳代比例1∶3。取生長狀態(tài)良好、對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

用100 ng/ml的LPS刺激J774A.1細胞制備炎癥反應細胞模型(LPS組)，以等體積PBS刺激的J774A.1細胞為對照組(PBS組)，繼續(xù)培養(yǎng)進行后續(xù)實驗。

在炎癥反應細胞模型中加入ERK5-IN-2作為抑制劑組，以ERK5-IN-2溶解液DMSO作為對照，繼續(xù)培養(yǎng)進行后續(xù)實驗。

1.2.2質粒轉染 預冷PBS物理吹打法解離對數(shù)生長期J774A.1細胞，以8×104～1×105個/孔均勻鋪于24孔板中，細胞密度達70%～90%時行脂質體質粒轉染，轉染shMIAT質粒為敲低(knock-down，KD)組，轉染shNC 質粒為陰性對照(negative control，NC)組。

1.2.3分離提取細胞總RNA、細胞核質DNA及RT-qPCR檢測 TRIzol法分別提取LPS組、PBS組、KD組、NC組、ERK5-IN-2組和DMSO組J774A.1細胞的總RNA。用核質分離試劑盒對LPS組及PBS組的細胞進行核質分離，分別提取細胞核、細胞質RNA。將RNA逆轉錄成cDNA，按SYBR Premix TaqⅡ試劑盒配制20 μl反應體系：TB Green 10 μl、cDNA 2 μl、上游引物1.6 μl(5 μmol/L)、下游引物1.6 μl(5 μmol/L)、RNase free 水 4.8 μl。反應條件如下：95℃預變性30 s；95℃ 5 s、60℃ 30 s，40個循環(huán)復性；94℃ 90 s、60℃ 180 s延伸，繪制擴增曲線。以GAPDH為細胞總RNA及細胞質RNA的內參基因，U6為細胞核RNA的內參基因，由2- ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 RT-qPCR primer sequences

1.2.4Western blot檢測蛋白表達 RIPA裂解液提取KD組、NC組、ERK5-IN-2組和DMSO組J774A.1細胞總蛋白,BCA試劑盒用于測定蛋白質濃度。上樣緩沖液經100℃變性10 min后行SDS-PAGE電泳(80 V 30 min，120 V 1 h)，轉膜(290 mA 90 min)，5% BSA封閉1 h，加GAPDH 抗體(1∶1 000)、NF-κB抗體(1∶1 000)、ERK 1/2抗體(1∶1 000)、ERK5抗體、STAT3抗體(1∶1 000)、p-NF-κB抗體(1∶2 000)、p-ERK1/2抗體(1∶2 000)、p-ERK5抗體(1∶2 000)、p-STAT3抗體(1∶2 000)4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，10 min/次，加辣根過氧化物酶標記的對應種屬來源二抗(1∶5 000)，室溫搖床孵育1 h后TBST漂洗3次，10 min/次，凝膠成像系統(tǒng)發(fā)光顯色。

1.2.5ELISA檢測IL-1β、TNF-α含量 收集LPS組和PBS組細胞上清，按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測細胞上清IL-1β、TNF-α含量。

2 結果

2.1炎癥反應細胞模型的制備 LPS組IL-1β、TNF-α mRNA表達分別為426.41±18.38、5.26±0.30，顯著高于PBS組(P<0.05)。LPS組細胞上清中IL-1β、TNF-α水平分別為(592.30±4.92)pg/ml、(433.70±14.62)pg/ml，顯著高于PBS組(P<0.05)。

2.2lncRNA MIAT 在LPS刺激J774A.1細胞的核質表達 lncRNA MIAT在LPS組的相對表達量顯著高于PBS組(P<0.05)，且主要表達于細胞核(圖1)。

圖1 lncRNA MIAT在LPS刺激的J774A.1細胞中的表達Fig.1 Expression of lncRNA MIAT in LPS stimulated J774A.1 cells

2.3lncRNA MIAT在J774A.1細胞的敲低效率及其對IL-1β、TNF-α mRNA表達的影響 KD組IL-1β、TNF-α mRNA相對表達量顯著高于NC組(P<0.05)。見圖2。

圖2 敲低J774A.1細胞中l(wèi)ncRNA MIAT表達Fig.2 Knocking down of lncRNA MIAT in J774A.1

2.4lncRNA MIAT對轉錄因子的影響 與NC組相比，KD組p-ERK5蛋白表達顯著提高 (P<0.05)；KD組p-NF-κB、p-STAT3、p-ERK1/2蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.29)。見圖3。

圖3 lncRNA MIAT對轉錄因子磷酸化的作用Fig.3 Effect of lncRNA MIAT on transcription factors phosphorylation

2.5ERK5-IN-2對ERK5抑制效率及ERK5抑制后IL-1β、TNF-α mRNA表達的影響 結果顯示，與DMSO對照組比，抑制劑組p-EKR5蛋白水平顯著降低(P<0.05)；IL-1β、TNF-α mRNA相對表達顯著下降(P<0.05)。見圖4。

圖4 ERK5磷酸化對IL-1β、TNF-α mRNA表達的影響Fig.4 Effect of ERK5 phosphorylation on the expression of IL-1β and TNF-α mRNA.

3 討論

盡管RA的病因及發(fā)病機制尚未明確，但隨著研究不斷深入，巨噬細胞在RA發(fā)病中的核心作用已得到廣泛認可[2,11,12]。因此巨噬細胞炎癥反應過程及機制的研究對揭示RA發(fā)病機制至關重要。lncRNAs是細胞因子等功能性蛋白的關鍵調節(jié)因素，在RA發(fā)病中的作用也被逐漸認可[13]。lncRNA MIAT被證實參與多種疾病的發(fā)生，可能與機體的炎癥反應有關[14]。由于lncRNA MIAT在骨髓中高表達，以單核巨噬細胞炎癥為主的骨髓水腫是RA早期的主要臨床表現(xiàn)之一[8,10]。因而，課題組猜測lncRNA MIAT可能通過參與巨噬細胞炎癥反應參與RA發(fā)病。本研究以小鼠巨噬細胞J774A.1為研究對象，探討lncRNA MIAT是否參與巨噬細胞炎癥反應及其可能參與的炎癥通路。

研究發(fā)現(xiàn)，與PBS組相比，lncRNA MIAT在LPS組細胞顯著高表達，提示lncRNA MIAT參與了炎癥反應過程，與既往研究提出的lncRNA MIAT參與炎癥反應的結論一致[9]。結果還證實lncRNA MIAT亞細胞定位主要位于細胞核，提示lncRNA MIAT主要發(fā)揮作用的部位可能在細胞核，但由于細胞質中l(wèi)ncRNA MIAT表達也相對增多，因此不能排除其可在細胞質發(fā)揮作用。為了進一步探索lncRNA MIAT對巨噬細胞炎癥反應的影響，課題組利用shMIAT敲低J774A.1細胞中l(wèi)ncRNA MIAT的表達。結果顯示炎癥因子IL-1β、TNF-α mRNA表達上調，提示lncRNA MIAT在巨噬細胞中可能發(fā)揮抑制炎癥的作用，為巨噬細胞炎癥反應的深入研究提供了新的對象。

NF-κB、STAT3等相關轉錄因子介導的炎癥通路是巨噬細胞炎癥反應的主要途徑[15]。NF-κB、ERK1/2、ERK5、STAT3等多種轉錄因子磷酸化后入核，可在細胞核內影響炎癥因子IL-1β、TNF-α轉錄[16-20]。lncRNAs可通過影響轉錄因子發(fā)揮調控作用[21]。因此推測，lncRNA MIAT可能通過影響與炎癥通路相關轉錄因子發(fā)揮抑制炎癥的作用。本研究分別對KD組及NC組J774A.1細胞的多種轉錄因子NF-κB、ERK1/2、ERK5、STAT3進行檢測，發(fā)現(xiàn)ERK5磷酸化水平在lncRNA MIAT的KD組顯著高于NC組，提示lncRNA MIAT可能參與抑制ERK5磷酸化。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在LPS刺激的J774A.1中加入ERK5特異性抑制劑ERK5-IN-2后，IL-1β、TNF-α mRNA表達明顯減少，表明ERK5磷酸化可促進炎癥因子的產生，與既往研究提出的ERK5可通過促進Toll樣受體2激活增強IL-1β、TNF-α表達的結論一致[20]。綜上所述，lncRNA MIAT可能通過抑制ERK5磷酸化通路減少IL-1β、TNF-α轉錄從而抑制巨噬細胞炎癥反應，在巨噬細胞炎癥反應中具有負向調控作用。

雖然lncRNA MIAT可能通過抑制ERK5磷酸化炎癥通路來抑制巨噬細胞炎癥反應，但在RA中l(wèi)ncRNA MIAT 與巨噬細胞炎癥是否存在確切關系需要通過收集臨床資料和動物實驗進一步證明。機體發(fā)生炎癥反應時，促炎因子大量釋放堆積，抑炎因子作用發(fā)生弱化。lncRNA MIAT抑制炎癥作用的發(fā)現(xiàn)，提示可以從促進抑炎基因表達的角度探索治療以RA為代表的炎癥疾病的新方向。