廣西人群miR-29b-2基因rs1474742 A/C和rs12401619 C/G多態(tài)性分布特征及其與血脂的關(guān)系①

何永玲 王彩梅 楊 峻 曾志能 喬永超 韋葉生

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，桂林 541000)

既往研究集中于探索編碼基因在疾病中的病理生理作用，隨著研究深入和技術(shù)進步，非編碼基因在疾病中的角色逐漸被重視，成為研究熱點[1,2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是由20～26個核苷酸構(gòu)成的高度保守的非編碼RNA，調(diào)控真核細胞的基因表達。研究表明，成熟的miRNA與靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)結(jié)合，抑制靶基因翻譯或涉及靶基因降解影響靶基因表達[3]。近年心腦血管疾病的發(fā)病率急劇上升，是當(dāng)今全球高發(fā)病率及高病死率的疾病之一[4]。血脂是多種心腦血管疾病的重要發(fā)病基礎(chǔ)，早期預(yù)防和控制血脂異常是避免該類疾病發(fā)生的重要手段。miR-29b-2多態(tài)性與血脂的關(guān)系尚未見報道。因此，本文研究其多態(tài)性在不同人群間的差異，并進一步探討其和血脂的關(guān)系，以期指導(dǎo)地區(qū)血脂防控，減少以血脂為發(fā)病基礎(chǔ)的疾病發(fā)生，為疾病易感性預(yù)防研究的基因位點選擇提供參考。

1 資料與方法

1.1資料 選取291名健康志愿者，均無心臟病史、中風(fēng)和血脂異常等相關(guān)疾病。年齡18～79歲，均來自廣西地區(qū)，且無血緣關(guān)系。本研究經(jīng)我院倫理委員會獲批準(zhǔn)，參與者知情同意。

1.2方法

1.2.1DNA抽提 取受試者靜脈血3 ml，DNA抽提試劑提取DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物合成 NCBI數(shù)據(jù)庫檢索miR-29b-2基因rs1474742A/C和rs12401619C/G序列，Primer 3.0軟件設(shè)計引物。rs1474742A/C位點F：5′-AGAGGCCTGAAAGGAAGCTAAAATATACACTT-3′，R：5′-AGAGGCCTGAAAGGAAGCTAAAATATACACT-G-3′；rs12401619C/G位點F：5′-CAAGCACCCTATC-TGCCTGAGC-3′，R：5′-CAAGCACCCTATCTGCCTGA-GG-3′。

1.2.3基因型檢測 SNPscan法檢測基因型，連接酶連接反應(yīng)的高特異性識別SNP位點等位基因，在連接探針末段引入不同長度的非特異序列及通過連接酶加接反應(yīng)獲得位點對應(yīng)的不同長度連接產(chǎn)物，標(biāo)記熒光的通用引物對連接產(chǎn)物進行PCR擴增，熒光毛細管電泳對擴增產(chǎn)物進行電泳分離，GeneMapper軟件分析各SNP位點的基因型。

1.2.4血脂水平檢測 受試者禁食并于清晨采集靜脈血3 ml，分離收集血清。生化分析儀分析血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和極低密度脂蛋白膽固醇(very low-density lipoprotein cholesterol，VLDL-C)水平。

2 結(jié)果

2.1基因型結(jié)果 獲得基因型均符合Hardy-Weinberg定律(P>0.05)，證明所選人群具有代表性。rs1474742A/C具有AA、AC和CC 3種基因型，rs12401619C/G具有CC、CG和GG 3種基因型。

2.2廣西人群多態(tài)性與其他人群比較 廣西人群rs1474742A/C基因型和等位基因頻率與美國人、歐洲人、日本人、意大利人和中國漢族人相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；廣西人群rs12401619C/G基因型和等位基因頻率與美國人、歐洲人、日本人、意大利人和中國漢族人相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1、2。

表1 廣西人群miR-29b-2基因rs1474742A/C多態(tài)性與其他人群比較[5]Tab.1 Comparison of polymorphism of rs1474742A/C in miR-29b-2 gene between Guangxi population and other populations[5]

2.3基因型和血脂水平相關(guān)性分析 各位點的基因型、志愿者年齡和性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。rs12401619C/G位點GG和CG的各項血脂指標(biāo)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。rs1474742A/C位點AC/AA和CC在LDL-C中的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表2 廣西人群miR-29b-2基因rs12401619C/G多態(tài)性與其他人群的比較Tab.2 Comparison of polymorphism of rs12401619C/G in miR-29b-2 between Guangxi population and other populations

表3 miR-29b-2基因rs12401619C/G基因型的各項指標(biāo)比較(mmol/L)Tab.3 Comparison of each item in genotypes of rs12401619C/G in miR-29b-2 gene(mmol/L)

表4 miR-29b-2基因rs1474742A/C基因型的各項指標(biāo)比較(mmol/L)Tab.4 Comparison of each item in genotypes of rs1474742A/C in miR-29b-2 gene(mmol/L)

3 討論

miRNA的拷貝或基因簇等形式是其存在于基因組的生物學(xué)特點，屬于基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的主要因子。miRNA對靶基因的影響取決于互補程度，即miRNA和靶基因完全配對結(jié)合時，導(dǎo)致靶基因降解，不完全配對則抑制靶基因翻譯。miR-29家族由miR-29a、miR-29b和miR-29c組成，其序列不同僅表現(xiàn)為少數(shù)堿基的差異，其靶基因參與細胞增殖、分化、凋亡和遷移等生物學(xué)活動[6]。動脈粥樣硬化表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細胞損壞，平滑肌增厚形成黃色或灰黃色，表現(xiàn)為斑塊，累及心臟、大腦和腎臟等器官，是引發(fā)心腦血管疾病的主要因素之一[7]。血脂水平促進動脈粥樣硬化斑塊形成，促使血液流變學(xué)產(chǎn)生變化，機體血液黏稠度增加，血管壁彈性降低，相關(guān)疾病發(fā)生風(fēng)險增加[8,9]。研究發(fā)現(xiàn)血脂異常類疾病與遺傳背景差異相關(guān)。Pereira-da-Silva等[10]發(fā)現(xiàn)miR-29在頸動脈粥樣硬化中呈低表達。動脈粥樣硬化斑塊的異常重塑導(dǎo)致血管破裂、急性心肌梗死和死亡。ECM(Col1A和Col3A)的miR-29靶基因上調(diào)，導(dǎo)致病變范圍縮小，纖維帽厚度增強，壞死區(qū)域減小[11]。HFD小鼠內(nèi)皮細胞凋亡水平明顯升高，其原因為Bcl-2蛋白減少。Bcl-2水平下降是由于miR-29水平上調(diào)，抑制其mRNA通過3′-UTR結(jié)合的翻譯[12]。miR-29過表達可降低己糖激酶2表達和活性，負調(diào)控脂肪酸氧化，可能通過調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活物-1α表達[13]。劉穎等[14]在HepG2細胞系轉(zhuǎn)染miR-29b-3p后，在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上調(diào)ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白A1(ABCA1)，而ABCA1是高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)合成調(diào)節(jié)的相關(guān)蛋白。ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化模型中，動脈粥樣硬化斑塊的產(chǎn)生可能與動脈粥樣硬化晚期MMP-9表達上升和miR-29b表達下降相關(guān)[15]。提示miR-29b是參與血脂相關(guān)疾病的關(guān)鍵基因。因此，研究miR-29b-2基因多態(tài)性與血脂的關(guān)系具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)廣西人群的rs1474742A/C和rs12401619C/G基因型和等位基因頻率與美國人、歐洲人、日本人和意大利人差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示廣西人群的多態(tài)性分布具有遺傳特征，可能與區(qū)域地理特點有關(guān)[16]。在基因多態(tài)性和血脂的關(guān)系分析中，rs1474742A/C位點的AC/AA和CC相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示其可能影響血脂代謝。啟動子對基因的表達水平起重要調(diào)節(jié)作用，s1474742A/C位點位于miR-29b-2基因的啟動子區(qū)，可能影響其表達并影響血脂代謝途徑。因此，研究基因多態(tài)性和疾病關(guān)系時，此類單核苷酸位點是優(yōu)先參考的篩選位點。

綜上所述，探索廣西人群miR-29b-2基因的rs1474742A/C位點和rs12401619C/G位點的特征將為個體精準(zhǔn)治療提供遺傳學(xué)基礎(chǔ)，充實我國群體基因型分布數(shù)據(jù)，為遺傳病研究及人類學(xué)研究提供準(zhǔn)確完整的數(shù)據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)rs1474742A/C多態(tài)性與血脂水平相關(guān)，為血脂相關(guān)疾病研究奠定了基礎(chǔ)。本研究尚存在不足，如朝鮮族是北方重要少數(shù)民族，其與地處南方的廣西人群多態(tài)性分布是否具有差異尚未闡明，因此，本課題組下一步將開展針對我國不同地區(qū)人群多態(tài)性差異的比較研究并闡明其對血脂影響的分子機制。本研究將為多態(tài)性在更多人群的研究數(shù)據(jù)及對以血脂為基礎(chǔ)的疾病研究提供方向。