星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化酒制巴戟天的炮制工藝

張成中，萬 赫，蔣益萍，賈 丹，馮坤苗，辛海量 （海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院：. 中藥鑒定學(xué)教研室；. 生藥學(xué)教研室，上海 200433）

巴戟天為茜草科植物巴戟天Morinda officinalisHow 的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，位列上品。后世歷代文獻(xiàn)多有記載，歷版《中國藥典》均有收載，其性溫，味辛、甘，歸肝、腎經(jīng)；具有補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕之功，臨床上常用于腎陽不足引起的陽痿遺精，宮冷不孕，月經(jīng)不調(diào)，少腹冷痛，風(fēng)寒濕邪引起的風(fēng)濕痹痛，筋骨痿軟。巴戟天含有蒽醌類、環(huán)烯醚萜苷類、低聚糖類等多種生物活性物質(zhì)，具有抗氧化[1]、免疫調(diào)節(jié)[2]、鎮(zhèn)痛抗炎[3]、抗骨質(zhì)疏松[4]、改善生殖能力[5]、抗疲勞[6]等藥理活性。傳統(tǒng)炮制理論認(rèn)為酒能行藥勢(shì)，活血通絡(luò)，祛風(fēng)散寒，巴戟天溫腎壯陽、強(qiáng)筋健骨、祛風(fēng)除濕的功效在酒制后得以增強(qiáng)。查閱古籍中的酒制巴戟天的炮制方法記載數(shù)量最多，酒制巴戟天的方劑在現(xiàn)代中醫(yī)臨床仍廣泛應(yīng)用，但是由于尚無法定統(tǒng)一的炮制工藝，現(xiàn)代研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)在整理、考證巴戟天古今炮制方法文獻(xiàn)記載的基礎(chǔ)上，以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，以水晶蘭苷為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選炮制工藝參數(shù)，利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法，建立酒制巴戟天的最佳炮制工藝。

1 材料與儀器

1.1 材料

巴戟天（廣東德慶采集2 批、安徽萬生中藥飲片有限公司購買1 批）；乙腈、甲醇（色譜純）、甲酸、乙醇等試劑（國藥集團(tuán)）；水晶蘭苷（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111 870-201 303）。

1.2 儀器

E100H 型超聲波清洗儀（德國Elma 公司）；梅特勒-托利多分析天平（METTLER TOLEDO 公司）；GZX-9023MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 (上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；超聲波提取儀（上海精密儀器儀表有限公司）；FST-ID-2.0 普利菲爾超純水機(jī)（上海富詩特儀器設(shè)備有限公司）；賽默飛U3000 系列液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；梅特勒-托利多分析天平（METTLERTO LEDO 公司）；Agilent1290 高效液相色譜儀串聯(lián)6 460 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(美國Agilent 公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 酒制工藝的選擇

2.1.1 檢測(cè)條件

流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸水溶液。洗脫程序：0～2 min，乙 腈7%→10%；2～6 min，乙 腈10%→45%；6～12 min，乙腈45%→60%；12～20 min，乙腈60%→90%；20～22 min，乙腈90%；22～24 min，乙腈90%→7%；24～26 min，乙腈7%；流速：0.2 ml/min；色譜柱：ZORBAX SB-C18600 Bar （2.1 mm×55 mm，1.8 μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量1 μl；電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式全掃描(Scans)；霧化器壓力45 psi，干燥器溫度300 ℃，干燥器流速8.0 L/min，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速11 L/min；毛細(xì)管電壓3.5 kV。

2.1.2 供試品制備

取凈巴戟肉，參照《中國藥典》（2015 年版）四部炮制通則（通則0213），分別炮制鹽制巴戟天、酒蒸巴戟天等。再取巴戟肉、鹽制巴戟天、酒蒸巴戟天適量，粉碎，分別取2.5 g，加入25 ml 乙醇，回流加熱1 h，冷卻過濾，作為醇提供試品溶液。另取巴戟天不同炮制品粉末各4.0 g，加100 ml 純水，振搖6 h 后過濾，作為水提供試品溶液。

2.1.3 巴戟天不同炮制品的質(zhì)譜差異

精密吸取供試品溶液各1 μl 注入超高效液相色譜儀，三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)。根據(jù)質(zhì)譜圖中母離子的豐度，比較幾種炮制方法對(duì)巴戟天活性成分的影響，可以發(fā)現(xiàn)鹽制巴戟天和酒蒸巴戟天無論是醇提物還是水提物母離子的種類以及相同母離子的豐度都有較大差異，可見酒制、鹽制的炮制工藝對(duì)巴戟天所含的活性成分具有一定影響（圖1、2）。其中，母離子389.0 為水晶蘭苷，可以作為主要檢測(cè)成分用于優(yōu)選巴戟天酒制的炮制工藝化合物指標(biāo)成分。從化學(xué)成分的變化角度來說，酒蒸后的巴戟天與鹽制巴戟天及巴戟肉成分上具有一定差異，可以作為酒制巴戟天的炮制工藝進(jìn)一步研究。

2.2 酒制巴戟天中水晶蘭苷的測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：C18柱 (150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸水溶液 (5∶95→28.8∶71.2，16 min)；流速為0.9 ml/min；檢測(cè)波長為238 nm；進(jìn)樣量20 μl。

2.2.2 供試品的制備

取酒制巴戟天粉碎，取0.25 g，精密稱定后，置150 ml 具塞三角瓶中，加入50 ml 溶劑[乙腈-0.1%磷酸水（9:1）]。超聲提取1 h 后，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

取水晶蘭苷對(duì)照品0.009 55 g，精密稱定，置25 ml 棕色容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容，制成濃度為0.382 mg/ml 的溶液，備用。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別取對(duì)照品儲(chǔ)備液5、4、3、2、1 ml 置10 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，分別測(cè)定峰面積。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=324.83X+1.452 8，相關(guān)系數(shù)r＝0.999 8。

2.2.5 測(cè)定方法

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 ml 置10 ml 量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制成對(duì)照品溶液。分別精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定（圖3、4）。

2.3 酒制巴戟天炮制工藝優(yōu)化

2.3.1 炮制時(shí)間的影響

取巴戟天原藥材100 g，12 份，加固定量10%黃酒，分別浸潤[7]0.5、1、2、4、6、12 h 后，蒸1 h。按“2.2 項(xiàng)”所述方法測(cè)定各指標(biāo)性成分水晶蘭苷的含量，通過對(duì)不同的浸潤時(shí)間進(jìn)行評(píng)價(jià)，得出浸潤時(shí)間為1 h 最佳。

2.3.2 黃酒用量的影響

取巴戟天原藥材100 g，6 份，分別加入 5%、10%、20%黃酒，浸潤1 h，蒸1 h 后干燥。按“2.2 項(xiàng)”所述方法測(cè)定各指標(biāo)性成分水晶蘭苷的含量，通過對(duì)黃酒不同加入量進(jìn)行評(píng)價(jià)，得出10%量時(shí)最佳。

2.3.3 效應(yīng)面法優(yōu)化和預(yù)測(cè)評(píng)價(jià)

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件，繪制黃酒用量、浸潤時(shí)間兩個(gè)因素和水晶蘭苷含量的三維效應(yīng)面來確定最佳炮制工藝（圖5）。

比較浸潤時(shí)間和黃酒用量兩個(gè)因素對(duì)水晶蘭苷含量的影響，可以看出隨著黃酒用量的增多，曲面變化較大，而隨著浸潤時(shí)間的增加，曲面趨于平緩。因此，黃酒用量對(duì)巴戟天中水晶蘭苷的量影響更大。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)經(jīng)濟(jì)效益，生產(chǎn)實(shí)際并結(jié)合Design Expert 8.0.6 軟件的計(jì)算結(jié)果，得出酒制巴戟天的最佳炮制工藝為：加黃酒量10%，浸潤1 h。按照篩選出的巴戟天最佳炮制工藝條件，重新測(cè)定原樣品3 次，所得酒制巴戟天呈短段狀；表面灰黃色或暗灰色；具縱紋或橫裂紋；切面皮部厚、紫色或淡紫色，中空；微有酒香氣，味甘微澀，測(cè)得濃度平均值為0.438%，與理論預(yù)測(cè)值0.456%之間的相對(duì)誤差[（預(yù)測(cè)值－實(shí)際值）÷預(yù)測(cè)值]為3.89%（＜5%）。

3 討論

巴戟天為常用補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕類中藥，臨床上鹽制巴戟天、酒制巴戟天等炮制規(guī)格均有廣泛應(yīng)用，根據(jù)中藥炮制理論分析，酒制可以增強(qiáng)巴戟天活血通絡(luò)、祛風(fēng)除濕之功，且有利于有效成分的煎煮溶出。酒制是較早形成的巴戟天炮制方法，且歷代均有沿用，并在明、清兩代達(dá)到鼎盛時(shí)期，巴戟天炮制方法尤其是酒制傳承有序，繼承與發(fā)展并行[8]。但現(xiàn)行版《中國藥典》并未收載酒制巴戟天，其他地方標(biāo)準(zhǔn)中僅《廣東省中藥飲片炮制規(guī)范》有收載，目前尚缺少統(tǒng)一明確的炮制規(guī)范及標(biāo)準(zhǔn)，建立符合臨床要求及藥典規(guī)范的炮制工藝對(duì)酒制巴戟天的應(yīng)用具有實(shí)際價(jià)值。鐘成等[9]研究發(fā)現(xiàn)酒制對(duì)巴戟天中蒽醌類成分的影響與鹽制相似，HPLC 檢測(cè)除共有峰之外，另有新的化合物峰出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過UPLC-MS 初步分析發(fā)現(xiàn)，巴戟天鹽制、酒制后水提液、醇提液中化合物母離子的種類以及相同母離子的豐度均有一定差異，其中，水晶蘭苷的豐度有較大差異，因此，建立酒制巴戟天的炮制工藝從成分變化上看有一定的必要性，酒制巴戟天的炮制工藝可以通過監(jiān)測(cè)水晶蘭苷的變化開展實(shí)驗(yàn)。

巴戟天中所含的水晶蘭苷等環(huán)烯醚萜類成分可抑制破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性，降低破骨細(xì)胞的骨吸收能力，抑制骨丟失；減緩佐劑和Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和骨質(zhì)丟失，顯示出良好的抗骨質(zhì)疏松和抗炎作用[10]。巴戟天醇提物能夠減輕大鼠關(guān)節(jié)佐劑誘導(dǎo)的足腫脹，降低血清中TNF-α、IL-lβ、IL-6 水平，表現(xiàn)出抗炎的藥理活性。水晶蘭苷可通過上調(diào)大鼠軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成，具有顯著降低MMP-3、MMP-13 表達(dá)，增強(qiáng)COL2A1 表達(dá)的作用，顯示出抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡和異化的作用[11]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)水晶蘭苷能夠顯著降低細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生，促進(jìn)成骨細(xì)胞的生成，減少骨丟失[12]。巴戟天酒制的主要目的增強(qiáng)其祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨的功效，藥理活性試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了巴戟天中水晶蘭苷對(duì)巴戟天的強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效發(fā)揮了作用，因此，采用水晶蘭苷而非常用的糖類作為評(píng)價(jià)巴戟天酒制炮制工藝的指標(biāo)成分相對(duì)而言更為合理。

影響巴戟天酒制工藝的因素包括黃酒用量、浸潤時(shí)間、蒸制時(shí)間等，優(yōu)化炮制工藝時(shí)可通過單因素考察、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法[13]、星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法[14]等數(shù)學(xué)模型進(jìn)行選擇。單因素考察僅單獨(dú)考察某一個(gè)因素的影響，可用于初步預(yù)實(shí)驗(yàn)，但難以全面考察整體優(yōu)化效果。正交試驗(yàn)通過合理安排試驗(yàn)并同時(shí)考慮幾種相關(guān)因素尋找最佳因素水平組合，但很難找到一個(gè)適合的試驗(yàn)最優(yōu)值。星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法是通過合理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果、運(yùn)用非線性數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，對(duì)炮制工藝進(jìn)行優(yōu)化，可以擬合出各個(gè)考察因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，直接看出最佳優(yōu)化的效應(yīng)區(qū)域[15]。筆者采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法，以黃酒用量、輔料浸潤時(shí)間為考察因素，以水晶蘭苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化酒蒸巴戟天炮制工藝，得到最佳炮制工藝為黃酒用量10%，浸潤1 h，蒸透，干燥，所得酒制巴戟天呈短段狀；表面灰黃色或暗灰色；具縱紋或橫裂紋；切面皮部厚、紫色或淡紫色，中空；微有酒香氣，味甘微澀；色澤均勻，質(zhì)韌，無碎屑藥渣。

酒制工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過程中，蒸藥時(shí)長的考察隨藥材的大小分檔、炮制的藥量變化，蒸透為度，固定規(guī)格和炮制藥量時(shí)，蒸制0.5～1 h 幾乎無差異，故本實(shí)驗(yàn)蒸制1 h，未再設(shè)置蒸制時(shí)長的考察參數(shù)。實(shí)驗(yàn)中考察了酒蒸與酒炒的差異，UPLC-MS 初步分析時(shí)，未見明顯差異，酒炒相對(duì)于酒蒸，炮制工藝較為煩瑣，翻炒、火候、出鍋時(shí)機(jī)、成品性狀、藥材破碎等不易于量化控制，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇酒蒸作為酒制巴戟天的炮制工藝予以優(yōu)化。