黃連提取物減輕膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的代謝組學(xué)研究

鄭約楠，邵國(guó)建，張一帆，邵玲就，周 琪，司亞晨 （. 溫州市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，浙江 溫州 35000；. 海軍軍醫(yī)大學(xué)研究生院，上海 00433）

膿毒癥作為機(jī)體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)的器官功能障礙綜合征，常累及腎臟，是危重患者發(fā)生急性腎損傷最常見的原因之一。膿毒癥引起的急性腎損傷不僅使住院死亡率增加6～8 倍，還與遠(yuǎn)期慢性腎臟病的發(fā)展和遠(yuǎn)期死亡風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[1-3]。通常認(rèn)為膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的發(fā)病過程與過度炎癥反應(yīng)、血流動(dòng)力學(xué)障礙、凝血功能障礙、小管上皮細(xì)胞損害等有關(guān)[1]，然而，膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的機(jī)制尚未完全闡明。近年來，代謝組學(xué)作為反應(yīng)疾病內(nèi)環(huán)境與內(nèi)源性代謝物之間關(guān)系的一種方法，被廣泛應(yīng)用于各種疾病，因此，利用代謝組學(xué)探究膿毒癥相關(guān)急性腎損傷中內(nèi)源性代謝物的變化有助于進(jìn)一步理解其發(fā)病機(jī)制。黃連作為常見中藥，具有抗炎、抗氧化等功能，被廣泛用于各種疾病[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)黃連可以通過減輕炎癥改善膿毒癥誘導(dǎo)的急性肝損傷[5]，而黃連是否對(duì)膿毒癥相關(guān)急性腎損傷存在保護(hù)作用還有待進(jìn)一步研究。本研究旨在研究黃連對(duì)膿毒癥相關(guān)腎損傷的影響，并利用代謝組學(xué)探討其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6 小鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司）；黃連生藥獲于安徽亳州；生化指標(biāo)試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；Agilent 7890A /5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)）；Agilent J&W Scientific HP-5ms（30 m × 0.25 mm，0.25 μm）毛細(xì)管色譜柱。

1.2 黃連提取物的準(zhǔn)備

黃連生藥由海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院孫連娜教授鑒定；根據(jù)《中國(guó)藥典》(2015 年版)準(zhǔn)備黃連水提取物。

1.3 動(dòng)物模型的建立及分組

采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）建立膿毒癥相關(guān)急性腎損傷模型。將18 只小鼠隨機(jī)分為3 組，每組6 只。具體分組如下，假手術(shù)組（Sham 組）：僅對(duì)小鼠切開縫合，并給予等體積生理鹽水灌胃；模型組（CLP 組）：小鼠行CLP，并給予等體積生理鹽水灌胃；給藥組（RCE 組）：小鼠行CLP，并給予黃連提取物100 mg/kg 灌胃。

1.4 標(biāo)本收集

干預(yù)完成24 h 后，對(duì)所有小鼠行內(nèi)眥靜脈取血，4 ℃冰箱靜置40 min 后，以3 000 r/min 離心5 min，取血清置于-80 ℃冰箱保存，以行生化指標(biāo)檢測(cè)。取血后處死小鼠，行心臟灌流，切取腎臟置于-80 ℃冰箱中保存，以行代謝組學(xué)分析。

1.5 生化指標(biāo)檢測(cè)

利用試劑盒檢測(cè)血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平。

1.6 代謝組學(xué)分析

取出-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存的腎組織，取皮髓交界部分，稱取50 mg 加入內(nèi)標(biāo)甲醇1 ml，再加入碾磨珠，4 ℃，70 Hz 碾磨120 s，再置入4 ℃離心機(jī)中，以12 000 r/min 離心10 min，取上清液200 μl 置離心管中，溫和氮?dú)獯蹈?。加?5 mg/ml 的甲氧胺吡啶溶液50 μl，渦旋30 s，置于70 ℃的烘箱中反應(yīng)60 min，再加入N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺（含1%的三甲基氯硅烷）50 μl，渦旋1 min，室溫反應(yīng)30 min，再加入100 μl 正庚烷，渦旋30 s，4 000 r/min 離心5 min，取上清液100 μl 上樣。余上清液每個(gè)取10 μl 混合成質(zhì)量控制樣本（QC），渦旋后取100 μl 上樣。

采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）進(jìn)行代謝組學(xué)分析。儀器參數(shù)設(shè)定為：進(jìn)樣口溫度280 ℃，EI 離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，高純氦氣（純度＜99.999%）作為載氣，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0 μl。升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0 ℃，維持2 min，10 ℃/min的速度升至320 ℃，并維持6 min。采用全掃描模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，質(zhì)譜檢測(cè)范圍為50～550m/z。采用隨機(jī)順序進(jìn)行連續(xù)樣本分析，避免因儀器信號(hào)波動(dòng)造成的影響。

1.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

在R 軟件平臺(tái)下采用自寫的程序代碼進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，包括基線過濾、峰識(shí)別和積分，然后在TagFinder 軟件下進(jìn)行保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和質(zhì)譜碎片歸屬等分析，最后在Excel 軟件中進(jìn)行后期編輯，包括來自于柱流失和樣本制備造成的雜質(zhì)峰剔除和定量離子選擇等，將最終結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，包括變量（保留時(shí)間及質(zhì)荷比）、觀察量（樣本）和積分面積。本項(xiàng)目共得到1 234 個(gè)物質(zhì)（每組樣本至少存在80%以上的物質(zhì)）。將中心化和歸一化后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P V11.0 進(jìn)行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判別式分析（PLS-DA）進(jìn)行排列測(cè)試以評(píng)估模型的質(zhì)量，生成變量重要性投影（VIP），表示對(duì)每種代謝物離子的群間區(qū)分的貢獻(xiàn)。選擇VIP 值＞1.0 的代謝物用于進(jìn)一步分析。

2 結(jié)果

2.1 黃連提取物對(duì)膿毒癥相關(guān)腎損傷的作用

假手術(shù)組、模型組及給藥組Scr 水平分別為（9.83±1.95）、（50.83±13.53）、（29.67±4.96）μmol/L；BUN 水平分別為（8.08±0.84）、（27.67±5.22）、（16.33±2.69）mmol/L。模型組較假手術(shù)組Scr 水平、BUN水平均上調(diào)；而給藥組較模型組均下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1），表明黃連提取物在膿毒癥相關(guān)急性腎損傷中可改善腎功能。

表1 黃連提取物對(duì)小鼠外周血生化指標(biāo)的影響

2.2 代謝組學(xué)分析

2.2.1 小鼠腎組織代謝輪廓分析

按照上述色譜-質(zhì)譜條件，分別對(duì)各組樣品進(jìn)樣分析，得到典型的總離子流圖（圖1）。

2.2.2 PCA 得分圖及系統(tǒng)穩(wěn)定性分析

采用PCA 方法對(duì)各組樣本進(jìn)行整體分析，并通過質(zhì)量控制樣本的聚集程度對(duì)系統(tǒng)的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。根據(jù)整體PCA 得分圖（圖2）所示，質(zhì)量控制樣本均聚集良好，其離散度明顯低于待分析樣本的離散度，表明系統(tǒng)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 PLS-DA 得分圖

采用PLS-DA 方法對(duì)假手術(shù)組、模型組、給藥組樣本進(jìn)行分析。首先對(duì)假手術(shù)組和模型組單獨(dú)進(jìn)行分析，兩組在正/負(fù)離子模式下的得分圖顯示，假手術(shù)組與模型組區(qū)分明顯（圖3）。進(jìn)一步對(duì)3 組樣本進(jìn)行分析，3 組在正/負(fù)離子模式下的得分圖顯示，假手術(shù)組與模型組有較明顯的區(qū)分趨勢(shì)，同時(shí)，給藥組較模型組有一定程度的回調(diào)（圖4）。提示膿毒癥相關(guān)急性腎損傷中，經(jīng)黃連提取物干預(yù)后，代謝物變化發(fā)生回調(diào)。

2.2.4 差異代謝物篩選

S-plot 可以很好地反映各個(gè)離子對(duì)組間差異的貢獻(xiàn)程度，離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的點(diǎn)表明其對(duì)組間差異的貢獻(xiàn)度越大，其VIP 值也越大。正離子模式下對(duì)照組和模型組的S-plot 顯示兩組間存在差異代謝物（圖5）。

在VIP 值＞1，且3 組ANOVA 分析以及Turkey兩兩分析P值均＜0.05 的條件下，共篩選并鑒別出16 個(gè)差異代謝物，包括天冬氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、酪氨酸、色氨酸、磷酸、蘋果酸、檸檬酸、果糖、葡萄糖、松二糖、肌醇，主要參與氨基酸代謝和糖代謝（表2）。在這16 個(gè)代謝物中，其中8 個(gè)代謝物水平在黃連提取物干預(yù)下發(fā)生回調(diào)，它們是天冬氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、檸檬酸、葡萄糖、肌醇。提示黃連提取物可能通過改善膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的代謝物變化從而起到治療作用。

3 討論

膿毒癥是由機(jī)體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)所引起的威脅生命的多器官系統(tǒng)功能障礙，而急性腎損傷是最常見的情況，多發(fā)生在膿毒癥早期。約51%的膿毒癥患者會(huì)發(fā)生急性腎損傷，導(dǎo)致病死率增高41%[6]。與非膿毒癥性急性腎損傷比較，膿毒癥相關(guān)急性腎損傷起病更急、腎功能損害程度更嚴(yán)重、系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)更重、器官功能衰竭評(píng)分也更高[7]。目前，我們對(duì)急性腎損傷發(fā)病機(jī)制的了解有限，腎血管收縮和腎血流減少導(dǎo)致腎缺血，促炎和抗炎反應(yīng)的早期激活，以及腎小管細(xì)胞的凋亡均可導(dǎo)致腎損傷[8]。由于腎臟是排泄代謝終產(chǎn)物的主要器官，故其損傷必然會(huì)引起腎臟代謝狀況的改變。

表2 膿毒癥相關(guān)腎損傷差異代謝物及代謝途徑

近年來，中草藥在世界范圍內(nèi)得到越來越多的認(rèn)可，而黃連以其瀉火解毒、清熱燥濕的功效被廣泛使用。黃連的主要成分包括小檗堿、巴馬汀、藥根堿等生物堿類[9]。大量研究表明，黃連具有抗菌、消炎、抗高血壓、抗氧化、降糖和降膽固醇的作用，具有很強(qiáng)的臨床使用意義[10]。Huang 等[11]研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯能通過抑制炎癥反應(yīng)延長(zhǎng)膿毒癥大鼠的生存時(shí)間，有效保護(hù)心肌細(xì)胞。Zhang 等[12]證實(shí)黃連對(duì)慢性腎功能衰竭大鼠的腎功能有一定的改善作用。代謝組學(xué)通過考察生物體受刺激后代謝產(chǎn)物的變化，以研究生物體代謝途徑，研究對(duì)象包括代謝中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物等體內(nèi)小分子代謝物[13]。黃連對(duì)膿毒癥相關(guān)的急性腎損傷有何影響，是否具有保護(hù)作用，本研究利用基于GC-MS 的代謝組學(xué)對(duì)此進(jìn)一步探討。

本研究通過代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)共有16 個(gè)代謝物與膿毒癥相關(guān)急性腎損傷有關(guān)，主要參與氨基酸代謝和糖代謝。在這些代謝物中，有8 個(gè)代謝物在黃連提取物干預(yù)后發(fā)生回調(diào)。

在氨基酸代謝中，天冬氨酸水平在膿毒癥相關(guān)急性腎損傷中降低，甘氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸水平升高，這些代謝物在黃連提取物干預(yù)后都發(fā)生了回調(diào)。既往研究提示，膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的腎組織中，天冬氨酸和蘇氨酸水平均降低[8]，可能是由于防御和修復(fù)過程中的蛋白質(zhì)合成增加了氨基酸的消耗，這與本課題組的結(jié)果存在部分差異，可能需要進(jìn)一步通過血液及尿液樣本進(jìn)行研究及探討。甘氨酸作為一種抗炎、抗氧化的保護(hù)劑，有研究提示甘氨酸衍生物可以通過減輕脂質(zhì)過氧化從而改善腎缺血/再灌注損傷[14]。有趣的是，另有研究顯示甘氨酸通過激活N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體加重氧化應(yīng)激以及腎缺血/再灌注損傷[15]。因此，課題組推測(cè)膿毒癥相關(guān)急性腎損傷中，甘氨酸水平升高一方面可能起到自我保護(hù)作用，而另一方面可能加重腎損傷；黃連提取物可能通過減少甘氨酸從而抑制NMDA 受體的激活，減輕膿毒癥相關(guān)急性腎損傷。苯丙氨酸通過苯丙氨酸羥化酶生成酪氨酸，在慢性腎臟病患者中，苯丙氨酸水平升高，酪氨酸水平降低，這可能與苯丙氨酸羥化酶活性降低相關(guān)[16]。而在膿毒癥相關(guān)急性腎損傷中，苯丙氨酸及酪氨酸水平均升高，提示該過程中苯丙氨酸羥化酶活性可能未發(fā)生明顯變化，而可能與其他代謝途徑相關(guān)。對(duì)甲酚硫酸鹽作為一種尿毒癥毒素，為腸道細(xì)菌代謝酪氨酸、苯丙氨酸的產(chǎn)物。在膿毒癥情況下，腸道微環(huán)境收到干擾[17]，我們推測(cè)苯丙氨酸及酪氨酸水平的升高可能進(jìn)一步引起對(duì)甲酚硫酸鹽水平的升高，加重腎損傷。既往有研究提示，黃連可以調(diào)節(jié)腸道菌群[18]，我們推測(cè)黃連可能通過聯(lián)合改善內(nèi)源代謝變化和調(diào)節(jié)腸道環(huán)境對(duì)膿毒癥相關(guān)急性腎損傷起到保護(hù)作用。

在糖代謝中，檸檬酸水平在膿毒癥相關(guān)急性腎損傷中降低，葡萄糖和肌醇水平升高，這些代謝物在黃連提取物干預(yù)后都發(fā)生了回調(diào)。曾有研究表明，檸檬酸循環(huán)是膿毒癥中受影響最大的代謝途徑[19]。在膿毒癥相關(guān)急性腎損傷模型中，三羧酸循環(huán)/氧化磷酸化過程減弱，糖酵解過程增強(qiáng)，這一代謝重編程現(xiàn)象稱為瓦博格效應(yīng)[20]。檸檬酸水平的降低也驗(yàn)證了這一現(xiàn)象。葡萄糖水平升高的可能原因是糖異生維持內(nèi)源性葡萄糖生成，以防止低血糖的發(fā)展，從而建立膿毒癥耐受性[21]。膿毒癥時(shí)，體內(nèi)迅速升高的升糖激素和前炎性因子加重了這一現(xiàn)象。但是，糖異生過程增強(qiáng)可能進(jìn)一步減弱氧化磷酸化過程，我們推測(cè)黃連提取物可能通過抑制糖酵解、增強(qiáng)氧化磷酸化，從而增強(qiáng)機(jī)體抗炎能力，減輕膿毒癥相關(guān)急性腎損傷。

本研究尚有一些不足之處，主要在于分析黃連提取物功效時(shí)局限于膿毒癥的某一時(shí)間點(diǎn)，而不能獲知膿毒癥相關(guān)性急性腎損傷全病程中腎損傷的情況，以及黃連提取物對(duì)腎臟的保護(hù)作用。其次，收集樣本的手段比較簡(jiǎn)單，難以消除潛在的影響因素?？傊?，黃連提取物可能通過改善膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的代謝物變化從而起到治療作用，但其中的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。這一研究結(jié)果表明，黃連具有成為膿毒癥相關(guān)急性腎損傷新的治療手段的潛質(zhì)，盡管可行性需要更多驗(yàn)證，但為治療膿毒癥相關(guān)急性腎損傷提供了新的思路。