50例胚胎植入前遺傳學(xué)診斷的臨床資料分析

陳蕾，李敏，黃影，揣云海，舒明明，朱海燕

(中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科，北京 100048)

遺傳性疾病是威脅人類健康的主要疾病之一，可導(dǎo)致嚴(yán)重的出生缺陷。胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(Preimplantation genetic diagnosis，PGD)是在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)的基礎(chǔ)上，對具有遺傳性疾病風(fēng)險(xiǎn)夫婦的卵母細(xì)胞或者植入前的胚胎進(jìn)行活檢，利用分子生物學(xué)技術(shù)對胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)檢測，篩選出無遺傳性疾病的胚胎進(jìn)行植入[1]。PGD主要針對已經(jīng)明確病因的遺傳性疾病家系，在種植前對胚胎進(jìn)行相應(yīng)的遺傳學(xué)診斷，主要包括單基因病(如地中海貧血、遺傳性耳聾等)和染色體病(如羅氏易位、平衡易位等)，選擇沒有發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的胚胎移植，一方面可以從源頭上杜絕患病兒出生，另一方面也可以避免因反復(fù)人工流產(chǎn)或引產(chǎn)導(dǎo)致的身體和精神上的創(chuàng)傷[2-3]。本研究通過對40例染色體病和10例單基因病患者的PGD臨床資料進(jìn)行詳細(xì)分析，以期為今后此類患者的診療及遺傳咨詢提供一定依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

選取2017年1月至2019年1月在解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科生殖中心就診并完成IVF/ICSI助孕周期及PGD的50對夫婦，其中40例是夫妻之一為染色體結(jié)構(gòu)異常攜帶者，10例為單基因病家族史、夫妻一方或雙方為致病基因攜帶者。對患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析。

二、研究方法

1.IVF/ICSI-ET方案：所有患者均采用本中心制定的常規(guī)促排卵方案，如長方案、拮抗劑方案、微刺激方案、高孕激素狀態(tài)下促排卵方案(PPOS方案)及短方案等。所用的促排卵藥物為重組人卵泡刺激素(r-hFSH，默克，德國)，拮抗劑為西曲瑞克(思澤凱，默克，德國)，長方案所用的降調(diào)藥為促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a，曲普瑞林，達(dá)菲林，益普生，法國)。行B超檢查監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，當(dāng)卵泡直徑≥18 mm時(shí)，給予人絨毛膜促性腺激素(HCG，默克，德國)10 000 U肌肉注射。34～36 h后，在B超引導(dǎo)下進(jìn)行負(fù)壓抽吸取卵。

2.胚胎培養(yǎng)：將受精卵放入卵裂期培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，液滴大小20 μl，每個(gè)液滴放入3～5個(gè)卵裂期胚胎，放入三氣培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)至第3天將卵裂期胚胎轉(zhuǎn)移入事先經(jīng)CO2平衡的囊胚培養(yǎng)液進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，每個(gè)液滴(20l)放1個(gè)胚胎，放入三氣培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至第5天(D5)、D6后，根據(jù)Gardner評分標(biāo)準(zhǔn)對囊胚進(jìn)行評分。

3.囊胚期活檢：選取D5或D6囊胚進(jìn)行滋養(yǎng)外胚層活檢，選擇內(nèi)細(xì)胞團(tuán)對側(cè)采用激光破膜系統(tǒng)在透明帶上打孔，之后繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，使部分滋養(yǎng)層形成疝后更利于囊胚活檢?；顧z時(shí)，讓內(nèi)細(xì)胞團(tuán)位于固定針一側(cè)，活檢針靠近形成疝的外滋養(yǎng)層細(xì)胞緩慢回吸，并利用激光打孔，直至活檢的外滋養(yǎng)層細(xì)胞全部脫離囊胚，活檢后囊胚繼續(xù)培養(yǎng)30 min后冷凍保存?；顧z組織在配子緩沖液中清洗后裝入含有2 μl單細(xì)胞裂解液的PCR管中，-20℃冷凍保存待用。所有囊胚活檢后依據(jù)活檢報(bào)告進(jìn)行單囊胚移植。

4.單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增：應(yīng)用多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增法(multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)技術(shù)，對活檢細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(whole-genome amplification，WGA)。采用單細(xì)胞WGA試劑盒(江蘇億康公司)，按照操作說明，依次經(jīng)過細(xì)胞裂解、預(yù)擴(kuò)增、指數(shù)擴(kuò)增步驟進(jìn)行擴(kuò)增。

5.染色體拷貝數(shù)分析：單細(xì)胞WGA擴(kuò)增后的每個(gè)樣本產(chǎn)生約2 M reads的數(shù)據(jù)量，使用Illumina HiSeq 2500平臺(tái)，采用二代測序技術(shù)(Next generation sequencing，NGS)檢測胚胎染色體拷貝數(shù)，計(jì)算每個(gè)窗口的reads數(shù)目，并使用R語言對每個(gè)窗口的GC矯正之后的reads 數(shù)目進(jìn)行作圖，使拷貝數(shù)變異可視化。

6.單基因病胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(PGT)：10個(gè)單基因病家系先證者的基因診斷均在我院產(chǎn)前診斷中心完成，明確致病基因突變。不同基因的檢測方法不同，例如杜氏肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)家系的缺失突變采用多重連接依賴探針擴(kuò)增(Multiple Ligated Probe Amplification，MLPA)方法檢測，SCA3家系采用熒光定量PCR(qf-PCR)方法檢測，其他家系的點(diǎn)突變采用sanger測序法。單細(xì)胞WGA擴(kuò)增后，除針對不同家系進(jìn)行致病基因變異位點(diǎn)檢測之外，同時(shí)針對該病例涉及基因所在染色體多個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)進(jìn)行檢測，對胚胎及家系的進(jìn)行單體型分析，協(xié)助明確胚胎基因型。

7.產(chǎn)前診斷：所有孕婦在妊娠18～22 W進(jìn)行羊水穿刺，產(chǎn)前診斷，對胎兒進(jìn)行核型分析及基因檢測，再次復(fù)核患者核型和基因型。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、染色體病患者PGD臨床資料

40例染色體病家系中女方年齡25～43歲，平均(33.9±4.4)歲，共有6種染色體病，分別為平衡易位、倒位、羅氏易位、白血病骨髓移植后和多態(tài)性等。其中30例為平衡易位(男性17例，女性13例)，4例羅氏易位(男性3例，女性1例)，3例倒位(男性2例，女性1例)，2例反復(fù)胚胎停育(男方染色體多態(tài))，1例男性白血病骨髓移植后。最常見的病史為胚胎停育史(21例)，占52.5%(21/40)；其次為原發(fā)不孕(14例)，占35.0%(14/40)(表1)。

表1 染色體病夫婦資料信息

40例染色體結(jié)構(gòu)異常攜帶者病例共進(jìn)行了49個(gè)促排卵周期，形成了150個(gè)囊胚，全部采用囊胚活檢，成功率為100%。每個(gè)患者獲卵數(shù)為1～12個(gè)，平均(3.8±3.1)個(gè)；經(jīng)過PGD診斷后獲得可移植囊胚總數(shù)為39個(gè)，60%的患者獲得了可移植的囊胚(24/40)，每個(gè)患者獲得可移植囊胚數(shù)目范圍是0～9個(gè)，平均為(1.0±1.5)個(gè)。均為單囊胚移植，移植20人。臨床妊娠12人，流產(chǎn)2例，分娩10人，其中6例男嬰(剖宮產(chǎn)4例，順產(chǎn)2例)，4例女嬰(剖宮產(chǎn)3例，順產(chǎn)1例)。所有孕婦在孕中期均行羊膜腔穿刺產(chǎn)前診斷，核型分析均未見染色體拷貝數(shù)目異常。妊娠率60.0%(12/20)，分娩率50.0%(10/20)(表2)。

表2 染色體病患者PGD臨床資料

二、單基因病患者PGD臨床資料

10例單基因病家族史患者中，女性年齡23～38歲，平均(34.0±4.8)歲。共有7個(gè)病種，其中常染色體顯性遺傳性多囊腎3例，血友病2例；最常見的病史為不良產(chǎn)史和原發(fā)不孕各4例，其次為有家族史的患者2例(表3)。

表3 單基因病患者臨床資料信息

10例單基因病患者進(jìn)行了13個(gè)促排卵周期，獲得了68個(gè)囊胚并進(jìn)行了檢測，全部采用囊胚活檢，成功率為100%。每個(gè)患者獲卵數(shù)為1～10個(gè)，平均(6.8±3.4)個(gè)，經(jīng)過PGD基因檢測共獲得了24個(gè)可移植囊胚，每個(gè)患者獲得可移植囊胚數(shù)目范圍0～5個(gè)，平均為(2.4±1.8)個(gè)。全部采用單囊胚移植，移植9人，臨床妊娠5人；孕中期產(chǎn)前診斷，胎兒染色體核型均正常，單基因病家系胎兒基因型與PGD結(jié)果相符。1例孕24 W時(shí)自然流產(chǎn)；1例至文章撰寫時(shí)孕30 W；3例足月剖宮產(chǎn)，均健康。持續(xù)妊娠率55.6%(5/9)，分娩率33.3%(3/9)(表4)。

表4 單基因病患者PGD臨床資料

討 論

Handyside等[4]最早在1990年首次將PGD技術(shù)應(yīng)用于臨床，為5對X連鎖隱性遺傳病的夫婦進(jìn)行胚胎移植前診斷，最終有2對夫婦獲得了健康的雙胎女嬰。隨后這項(xiàng)技術(shù)迅速發(fā)展，特別是結(jié)合了輔助生殖技術(shù)，對有遺傳高風(fēng)險(xiǎn)的夫婦進(jìn)行PGT，可大大降低出生缺陷的發(fā)生[5]。目前針對胚胎染色體的PGT，根據(jù)檢測目，分為PGT非整倍體檢測(PGT for aneuploidy，PGT-A)、PGT染色體結(jié)構(gòu)異常檢測(PGT for chromosome structural rearrangements，PGT-SR)和PGT單基因病檢測(PGT for single gene/monogenic disorders，PGT-M)，PGT-A主要可檢測胚胎非整倍體、染色體部分缺失/重復(fù)(通?！? Mb)，PGT-SR可以了解胚胎的染色體是否存在結(jié)構(gòu)變異，即了解胚胎是否遺傳了親代染色體的易位、倒位等結(jié)構(gòu)異常。PGT-M用于單基因病的植入前檢測[6-7]。

染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常所導(dǎo)致的疾病稱為染色體疾病。有研究對流產(chǎn)、死產(chǎn)及新生兒和一般人群進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示染色體異常占流產(chǎn)胚胎的50%，占死產(chǎn)嬰兒的8‰，占新生兒死亡者的6‰[8]。在一般人群中相互易位占2‰左右，在染色體病中排在第1位；排在第2位的是羅氏易位，人群中頻率約為1‰，其中15%生育力低下。在自然流產(chǎn)夫婦中，易位的發(fā)生率顯著增高，可達(dá)5%～10%[9]。相互易位由于沒有遺傳物質(zhì)的丟失，本人無異常表型，但在其配子形成的減數(shù)分裂過程中，同源染色體重組可形成多種類型的遺傳物質(zhì)不平衡的配子，生育染色體異常后代幾率達(dá)到50%～100%，嚴(yán)重影響生育。PGT-SR的出現(xiàn)，給這類患者帶來了希望。Butler等[10]曾研究了28例PGT-SR患者，發(fā)現(xiàn)在IVF促排卵的過程中，60.7%的患者至少有1個(gè)正常的胚胎，胚胎移植后累積妊娠率為87.5%，持續(xù)妊娠或分娩率為42.9%。本研究的40例患者中，60%的患者有可移植胚胎，累計(jì)妊娠率為60.0%，與前述文獻(xiàn)比較，此兩項(xiàng)指標(biāo)相似，但本研究中分娩率(50.0%)更高一些。當(dāng)然分娩率的高低和PGT-SR結(jié)果、卵子數(shù)量、檢測的囊胚數(shù)及適宜移植胚胎數(shù)等均有顯著的相關(guān)性[11]。國際上多數(shù)生殖中心，PGT后每次胚胎移植的臨床妊娠率約為40%[2]，本研究數(shù)據(jù)略高于國際平均數(shù)據(jù)，這可能與我們的病例數(shù)少有關(guān)。

單基因病是由一對等位基因控制并因單個(gè)基因突變引起的疾病，一般涉及單個(gè)核苷酸到整個(gè)基因的改變。根據(jù)致病基因所在染色體及基因表現(xiàn)型的不同可以把孟德爾遺傳病分為常染色體(autosomal)遺傳和性連鎖(sex-linked)遺傳兩大類，兩者又分為顯性遺傳和隱性遺傳兩種。單基因病的發(fā)病主要在嬰幼兒、青少年時(shí)期，青少年后期發(fā)病者不到10%，最主要的臨床表現(xiàn)是智力障礙、生長發(fā)育遲緩、單器官或者多器官發(fā)育異常、聽力或者神經(jīng)、血液系統(tǒng)損害等[12]。因此很多夫婦因單基因病生育史，部分因單基因病家族史而就診，甚至部分夫妻因家族中有基因病患者不敢生育，對家庭造成嚴(yán)重影響。經(jīng)過PGT-M，可了解胚胎目的基因的基因型，選擇沒有發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的胚胎移植，以避免子代發(fā)病[13]；對于性連鎖的遺傳病，還可以通過對胚胎性別進(jìn)行鑒定，以避免子代發(fā)病的可能[14]。我們實(shí)驗(yàn)室對有血友病家族史的夫婦采用PGT-A結(jié)合PGT-M，選擇染色體平衡且未遺傳致病基因的胚胎植入，可以獲得健康嬰兒。

目前針對單基因病的PGD技術(shù)發(fā)展非?？?。本研究采用MALBAC擴(kuò)增測序的PGD，為了減少單細(xì)胞PCR中的高等位基因丟失的發(fā)生率，同時(shí)引入了胚胎植入前遺傳學(xué)單體型分析(preimplantation genetic haplotyping，PGH)技術(shù)。該技術(shù)通過對多個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測，并結(jié)合家系SNP單體型連鎖分析的策略，可以從理論上為模板中等位基因丟失的問題提供解決方案。

近年來，隨著PGD技術(shù)在各學(xué)科領(lǐng)域的擴(kuò)大應(yīng)用和發(fā)展，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注PGD子代的安全問題和倫理問題。Winter等[15]曾在研究中對經(jīng)PGD獲得活產(chǎn)(47例)、經(jīng)ICSI獲得活產(chǎn)(49例)及自然妊娠后分娩(48例)的5～6歲兒童的認(rèn)知發(fā)育和運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行隨訪評估，結(jié)果顯示PGD組兒童的兩項(xiàng)指標(biāo)和其他兩組比較并無顯著性差異，而自然妊娠組兒童和ICSI組兒童的運(yùn)動(dòng)能力比較存在顯著性差異。本研究納入的50例樣本人群中共分娩獲得新生兒13例，隨訪均無明顯出生缺陷發(fā)生；1例孕30 W，產(chǎn)檢胎兒健康。但PGD安全問題的探討，涉及的內(nèi)容比較多，也比較復(fù)雜，包括胚胎活檢、活檢的時(shí)期、活檢的方法及部位等，仍需要更長久和更多的病例分析來完成，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以支持本文結(jié)論。

總之，PGD技術(shù)的出現(xiàn)為染色體疾病的夫婦帶來了希望，由于本中心開展PGD工作量不大，診療病種不多，需積累更多的病例，一起為臨床提供更多的參考。NGS技術(shù)可以有效篩查出攜帶染色體病和單基因病的囊胚，避免移植此類囊胚，阻斷遺傳病的傳遞。