人卵母細胞體外成熟后受精所形成胚胎篩選模式的建立

狄春光，王慧，王功發(fā)，王毅，華科，王麗萍

(浙江省嘉興市婦幼保健院生殖中心，嘉興 314000)

卵母細胞體外成熟(in vitro maturation，IVM)是一項新的輔助生殖技術，可用于難治性多囊卵巢綜合征(PCOS)患者和促排卵周期中卵巢反應不良患者不成熟卵母細胞的體外培養(yǎng)成熟，目前國內外IVM技術并不是很成熟。有研究表明IVM后的卵母細胞紡錘體結構和染色體構型異常比例要高于正常胚胎[1]，因此如何在IVM胚胎中篩選出正常且發(fā)育潛能高的胚胎，是臨床上亟待解決的問題。目前的胚胎形態(tài)學評估只能在固定的時間點對胚胎進行觀察[2]，不能對影響胚胎發(fā)育潛能的非正常事件，如非二倍性卵裂等進行觀察評估，故胚胎形態(tài)學評估在不同發(fā)育潛能的胚胎篩選上有一定局限性[3]。而時差成像系統(tǒng)(time-lapse imaging，TLI)為非侵入性胚胎評估系統(tǒng)，通過對培養(yǎng)中的胚胎進行連續(xù)觀察，獲得與胚胎發(fā)育相關的動力學參數，從而準確評估其發(fā)育潛能[4-5]，是對胚胎形態(tài)學評估的一個有力補充。因此本研究利用TLI結合胚胎形態(tài)學評估方法建立一種新的IVM胚胎篩選模式，以期為臨床實踐中挑選高發(fā)育潛能的胚胎移植提供參考，以提高患者臨床妊娠率。

資料與方法

一、研究對象

收集2016年2月至2019年5月于本中心接受IVF/ICSI-ET助孕治療患者的402枚未成熟卵母細胞進行IVM培養(yǎng)。卵母細胞IVM后行ICSI授精，精子來源均為患者丈夫，受精后的胚胎在TLI系統(tǒng)中觀察培養(yǎng)。排除標準：合并艾滋病、梅毒、乙型肝炎抗原陽性患者。本研究通過本院醫(yī)學倫理委員會審查，所有患者夫妻雙方已簽署知情同意書。

二、研究方法

1.IVM培養(yǎng)液準備：G-2 plus胚胎培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)，含有0.2 μg/ml 17β-雌二醇(Sigma，美國)、75 U/L FSH和150 U/L HCG(Serono，瑞士)。

2.未成熟卵母細胞的收集及培養(yǎng)：所有患者從上一月經周期排卵后7 d或月經第2天開始注射達菲林(Ipsen，法國)針劑0. 1 mg/d，降調節(jié)至少14 d后檢查性激素水平，達降調水平，開始注射果納芬(Serono，瑞士)或麗申寶(珠海麗珠制藥)進行控制性促排卵，至雙側卵巢內有2個或2個以上的卵泡直徑達 18 mm時，注射重組HCG 250μg(Serono，瑞士)，36 h后在陰道超聲引導下取卵。ICSI前剝除卵母細胞周圍的大部分顆粒細胞，經倒置顯微鏡觀察卵母細胞的成熟程度，選擇未成熟卵母細胞(GV期或MI期)供本研究使用。將未成熟卵母細胞移入IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24～40 h，如果卵母細胞成熟則行ICSI受精，受精卵在TLI系統(tǒng)中培養(yǎng)。

3.TLI系統(tǒng)使用及胚胎培養(yǎng)：使用Primo Vision(Vitrolife，瑞典)TLI系統(tǒng)，圖像每5 min采集1次，共連續(xù)培養(yǎng)6 d。所有胚胎均采用WOW 9孔培養(yǎng)皿，卵裂期胚胎培養(yǎng)液為37℃、6%CO2平衡過夜的G-1 plus(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)液。囊胚培養(yǎng)為37℃、6%CO2平衡過夜的G-2 plus(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)液，培養(yǎng)過程中均有Primo Vision成像系統(tǒng)采集圖像，并進行胚胎發(fā)育的動力學參數與卵裂模式分析。

4.胚胎發(fā)育時間參數和卵裂模式設定：胚胎發(fā)育各時間點的命名方法參照Ciray標準[6]，將ICSI受精時間記為“0”點，原核消失時間(tPNF)，發(fā)育至2細胞時間為t2，發(fā)育至3細胞時間為t3，以此類推為t4、t5。2細胞發(fā)育至3細胞所需時間為cc2，3細胞發(fā)育至4細胞所需時間為s2，比較第3天(D3)IVM胚胎未形成囊胚組(A組)和形成囊胚組(B組)相應的動力學參數。胚胎的卵裂模式包括正常卵裂、非軸性卵裂、不均、卵裂球碎裂、非二倍性卵裂、發(fā)育停滯等。

5.胚胎評估標準：卵裂期胚胎評估參考Peter標準[7]，囊胚期胚胎評估參考Gardner標準[8]。D3可移植胚胎：細胞數≥4個，碎片≤30%，胚胎內無異常結構；D3優(yōu)選胚胎：細胞數7～12個，碎片≤20%；D3次選胚胎：D3可移植胚胎中優(yōu)選胚胎除外的胚胎。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0軟件對數據進行統(tǒng)計學分析。胚胎動力學參數tPNF、t2、t3、t4、t5、cc2、s2等計量資料不符合正態(tài)分布，以中位數(四分位數)[M(Q25，Q75)]表示，組間比較用非參數Kruskal-Wallis秩和檢驗。對非二倍性卵裂發(fā)生率、囊胚形成率等計數資料用頻數和率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、胚胎形態(tài)學評估選擇發(fā)育潛能更高的IVM胚胎

本研究共納入402枚未成熟卵母細胞進行IVM培養(yǎng)，共有315枚成熟，成熟率為78.4%；對315枚IVM成熟卵母細胞進行ICSI后，正常受精219枚，形成D3可移植胚胎數162枚。按胚胎形態(tài)學標準評估，在D3獲得優(yōu)選胚胎95枚，次選胚胎67枚。優(yōu)選胚胎和次選胚胎的囊胚形成率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 兩組囊胚形成率比較(%)

二、IVM胚胎卵裂模式與囊胚形成的關系

通過TLI觀察，我們發(fā)現在219枚受精卵中非二倍性卵裂的發(fā)生率最高(24.2%)，其后分別為正常卵裂(21.9%)、不均(17.8%)、發(fā)育停滯(16.9%)、非軸性卵裂(10.1%)、卵裂球碎裂(9.1%)。IVM胚胎中正常卵裂胚胎的囊胚形成能力最高(52.1%)，其次是非軸性卵裂胚胎(45.5%)，再次為分裂不均胚胎(35.9%)，卵裂球碎裂最低(10.0%)，發(fā)育停滯和非二倍性卵裂胚胎均無囊胚形成(表2)。

表2 IVM胚胎中各卵裂模式的發(fā)生率和囊胚形成率(n=219，%)

三、動力學參數對IVM胚胎發(fā)育潛能的預測性

D3 IVM胚胎未形成囊胚組(A組，111枚)和形成囊胚組(B組，51枚)相應的動力學參數進行比較，發(fā)現兩組動力學參數tPNF、t2、t3、cc2、s2比較均無顯著性差異(P>0.05)，t4、t5比較有顯著性差異(P<0.05)(表3)，提示t4、t5對IVM胚胎的發(fā)育潛能具有一定預測性。B組t4、t5的參數值范圍分別為(24.6～41.9)h和(26.1～56.9)h，該范圍內的IVM胚胎具有更高的囊胚形成能力。

表3 兩組動力學參數比較[M(Q25，Q75)，h]

四、TLI結合胚胎形態(tài)學評估建立IVM胚胎篩選模式

首先在D3 IVM胚胎中排除發(fā)生非二倍性卵裂的胚胎，非二倍性卵裂胚胎為廢棄胚胎(即E級胚胎)。然后再按胚胎形態(tài)學評估將IVM胚胎分為可移植胚胎和廢棄胚胎，繼續(xù)將可移植胚胎分為優(yōu)選胚胎和次選胚胎，結合形成囊胚最佳的t4、t5動力學參數范圍，再篩選出A、B、C、D四級胚胎。A級胚胎符合優(yōu)選胚胎標準，且胚胎t4、t5動力學參數均在最佳范圍內；B級胚胎符合優(yōu)選胚胎標準，胚胎t4、t5動力學參數不在最佳范圍內；C級胚胎符合次選胚胎標準，胚胎t4、t5動力學參數均在最佳范圍內；D級胚胎符合次選胚胎標準，胚胎t4、t5動力學參數不在最佳范圍內。胚胎移植或冷凍優(yōu)先級為A>B>C>D(圖1)。

圖1 IVM胚胎篩選模式

五、驗證篩選模式下所選胚胎的囊胚形成能力

再次收集123枚未成熟卵細胞，經IVM成熟92枚，受精后得到D3可移植胚胎43枚。在所建立的篩選模式下篩選出A級胚胎14枚、B級胚胎11枚、C級胚胎8枚、D級胚胎10枚，繼續(xù)囊胚培養(yǎng)，結果優(yōu)選胚胎囊胚形成率44.0%。該模式下各級胚胎的囊胚形成率如下：A(64.3%)>B(18.2%)>C(12.5%)>D(10.0%)。該模式所選出的A級胚胎囊胚形成率顯著高于優(yōu)選胚胎(64.3% vs. 44.0%)(P<0.05)，證實該篩選模式在IVM胚胎高發(fā)育潛能胚胎的篩選中有較高的應用價值。

討 論

如何快速有效地挑選高發(fā)育潛能的IVM胚胎，一直是臨床上亟待解決的問題。本研究中我們利用TLI系統(tǒng)結合卵裂期胚胎形態(tài)學評估，建立了有效準確的IVM胚胎篩選模式，有利于優(yōu)化篩選胚胎流程，快速挑選出高發(fā)育潛能的胚胎進行移植，經篩選后的A級胚胎囊胚形成率為64.3%，遠高于胚胎形態(tài)學評估所得優(yōu)選胚胎的囊胚形成率44.0%，具有非常大的臨床應用價值。

胚胎發(fā)育過程中，一些非正常事件的發(fā)生，如非二倍性卵裂、不均、發(fā)育停滯、非軸性卵裂、卵裂球碎裂等，都可能預示著胚胎未來的命運[9]。非正常事件中不均、發(fā)育停滯可以通過在D1、D2、D3等固定時間點對胚胎進行形態(tài)學觀察對照發(fā)現，而非二倍性卵裂、非軸性卵裂和卵裂球碎裂則很難被傳統(tǒng)胚胎形態(tài)學評估方法發(fā)現，TLI技術對胚胎不間斷地連續(xù)觀察，可獲取胚胎發(fā)育全過程的動態(tài)影像，能對胚胎發(fā)育進行更加全面和細致的記錄[10]，因此非軸性卵裂、非二倍性卵裂、卵裂球碎裂可在TLI觀察下迅速被發(fā)現。本研究中非軸性卵裂、卵裂球碎裂等胚胎均有囊胚形成，而非二倍體卵裂胚胎的囊胚形成率為0%，并且非二倍性卵裂發(fā)生率最高(24.2%)，因此我們認為在IVM胚胎篩選中應首先剔除非二倍性卵裂胚胎。王珊珊等[11]報道非二倍性卵裂胚胎的優(yōu)質囊胚形成率僅為2.16%。Athayde等[12]報道非二倍性卵裂胚胎的囊胚形成率為11.7%，種植率只有3.7%，建議非二倍性卵裂作為胚胎篩選的排除條件。因此，本研究中我們建立的IVM胚胎篩選模式中首要的排除條件為非二倍性卵裂胚胎。

目前已有很多研究將TLI技術運用到胚胎篩選評估中，主要通過胚胎動力學參數對胚胎發(fā)育潛能進行預測[13-15]。本研究中我們發(fā)現t4形成囊胚的最佳范圍為(24.6～41.9)h，當t4>41.9 h時囊胚形成能力下降。Yang等[16]利用TLI系統(tǒng)研究其動力學參數對138枚受精卵發(fā)育成囊胚的影響，發(fā)現當t4>41.3 h時，胚胎形成囊胚能力下降。與我們的結果相似，也從側面證實參數t4的重要性。t5同樣可以作為胚胎發(fā)育潛能的預測性參數，Meseguer等[15]對285例ICSI周期患者胚胎的卵裂時間、卵裂球大小和多核等做了詳細的回顧性分析，總共移植了522枚胚胎，結果顯示當t5最佳范圍為(48.8～56.6)h時，其胚胎種植率約40%，遠高于其范圍之外的種植率。本研究中我們確定的t5最佳范圍為(26.1～56.9)h，比Meseguer等[15]的確定范圍略大，分析其原因可能為各中心的促排卵方案、培養(yǎng)環(huán)境及人員操作等差異造成了各中心提取的共性參數有所不同。因此，各生殖中心應該根據最適合本中心的共性參數，挑選優(yōu)質胚胎進行移植。

胚胎形態(tài)學評估雖然有一定局限性，但其挑選的正常優(yōu)質胚胎的囊胚形成率依然可達60%以上，且效率遠高于TLI，依然是各大實驗室胚胎評估的主要方法。而TLI雖然有很多優(yōu)點，但考慮到價格因素，每臺TLI系統(tǒng)加上配套耗材估計使用價格達百萬元以上，因此現階段大規(guī)模的TLI應用還不現實，但對于反復移植失敗、高齡、需IVM等特殊患者的應用，能提高TLI的使用價值。尤其使用TLI結合胚胎形態(tài)學評估對胚胎進行篩選，可使篩選高發(fā)育潛能胚胎的效果得到提高[17-18]。對反復移植失敗、高齡、需IVM等患者而言，其胚胎染色體異常的概率遠大于正?；颊?，利用TLI結合胚胎形態(tài)學評估方法從中篩選高發(fā)育潛能的胚胎，可以顯著提高這些患者的妊娠率。本研究中我們進行IVM培養(yǎng)的不成熟卵母細胞是當患者的優(yōu)勢卵泡直徑達18 mm時經過取卵后獲得，患者所獲得的卵母細胞大部分已成熟，不成熟卵母細胞只占小部分，患者有足夠正常成熟卵母細胞來源的胚胎移植，因此IVM胚胎的臨床應用價值仍然具有一定局限性[19]。而在臨床上經典的IVM促排方案中，當優(yōu)勢卵泡直徑達10 mm～12 mm時，超聲引導下經取卵術獲得的卵母細胞均不成熟，經IVM培養(yǎng)后才能成熟，并具有受精形成胚胎的能力。因此臨床上經典的IVM促排方案對因卵泡發(fā)育遲緩影響卵母細胞成熟的不孕患者來說意義重大。利用TLI結合形態(tài)學評估方法建立的這種針對IVM胚胎的篩選模式，對經典IVM促排方案來源的IVM胚胎篩選，具有極高的借鑒和應用價值。