響應(yīng)面法優(yōu)化胰酶酶解魚溶漿的工藝研究

林曉華，司武陽

(安徽糧食工程職業(yè)學(xué)院 食品生物系，安徽 合肥 230011)

在農(nóng)業(yè)部第1773號公告中[1]，魚溶漿是由魚及其副產(chǎn)品加工而成的飼料原料，其特征描述為以魚粉加工過程中得到的壓榨液為原料，經(jīng)脫脂、濃縮或水解后再濃縮獲得的膏狀產(chǎn)品，產(chǎn)品中水分含量不高于50%。由于魚溶漿營養(yǎng)成分豐富，富含水溶性蛋白質(zhì)、小肽、游離氨基酸等，而且適口性好，還可以作為飼料誘食劑[2-4]。近幾年，隨著魚粉飼料原料的價格上漲，魚溶漿越來越多的被作為魚粉的替代品用在各種飼料配料中，具有添加量少，飼料效果好的特點[5-6]。但目前大多數(shù)企業(yè)對魚溶漿的研究都集中在其作為飼料的飼養(yǎng)效果上，對魚溶漿的制備工藝及質(zhì)量的基礎(chǔ)性研究較少[7-10]。

胰酶系自豬、羊或牛胰臟中提取的多種酶的混合物，主要為胰蛋白酶、胰淀粉酶與胰脂肪酶。胰酶的用途非常廣泛，是多國藥典收載的助消化藥品，治療消化不良、食欲不振及肝胰疾患引起的消化障礙[11-12]，除此還被運用于食品工業(yè)、精細(xì)化工、生物醫(yī)藥和蛋白質(zhì)水解等領(lǐng)域中[13-15]。目前有關(guān)胰酶制備的研究多是將胰酶激活后用有機溶劑沉淀，再用有機溶劑脫脂、干燥制備為粉末狀胰酶，但制備過程較為復(fù)雜，制備時間長，使得胰酶活性有一定的損失[16-18]。因此，本試驗直接使用激活后的胰酶酶液水解魚溶漿，簡化了胰酶制備過程，減少了有機溶劑的消耗，最大程度保留了胰酶的活性。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究酶解魚溶漿的工藝條件，優(yōu)化水解工藝參數(shù)，以期獲得更高質(zhì)量的魚溶漿產(chǎn)品，為魚粉加工企業(yè)對副產(chǎn)物的深加工提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 原料與試劑

豬胰臟由合肥市板橋生豬定點屠宰場提供，魚溶漿樣品由山東榮成海圣飼料有限公司提供。CaCl2、NaCl、NaOH、胰酶粉、土豆淀粉、鹽酸等試劑均購自國藥試劑。

1.2 胰酶激活及制備工藝

1.2.1 胰酶激活工藝路線 豬胰臟解凍→攪碎→提取→激活→過濾→保存待用。

1.2.2 酶活力測定方法 胰蛋白酶活力按照中華人民共和國藥典2015 版第二部胰蛋白酶效價測定法進(jìn)行檢測[19]。

1.3 魚溶漿酶解條件的選擇及酶解工藝優(yōu)化試驗

1.3.1 魚溶漿酶解工藝流程 魚溶漿→加水、調(diào)pH→加激活后的胰酶→酶解→滅酶→調(diào)pH至中性→濃縮→酶解魚溶漿。

1.3.2 魚溶漿酶解的單因素試驗 以酶解后的酸溶蛋白含量為指標(biāo)，分別以影響酶解效果的液料比、酶解溫度、胰酶用量、pH及酶解時間做單因素試驗。試驗因素及水平見表1。

表1 單因素試驗因素及水平

1.3.3 魚溶漿酶解條件優(yōu)化試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，根據(jù) Box-behnken中心組合實驗法，選取對酶解效果影響顯著的因素，以酸溶蛋白含量為響應(yīng)值，進(jìn)一步優(yōu)化魚溶漿的酶解條件。

1.3.4 酶解魚溶漿酸溶蛋白的測定 酸溶蛋白含量的測定參考GB/T 22729—2008中方法。低分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)水解物(包括小肽和游離氨基酸)可溶于三氯乙酸溶液；高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)在三氯乙酸溶液中易沉淀。樣品經(jīng)三氯乙酸溶液溶解后，離心分離出沉淀蛋白質(zhì)，收集離心清液，測定離心清液的酸溶蛋白質(zhì)水解物含量，清液的酸溶蛋白質(zhì)水解物含量減去游離氨基酸含量得到小肽的含量[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究運用 Design expert8.0.6 軟件進(jìn)行中心點試驗設(shè)計和方差分析，試驗數(shù)均以 x±s 表示。各組數(shù)據(jù)均數(shù)間用 t 檢驗判斷其差異顯著性。P<0.05 為顯著性差異，P<0.01 為極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 胰酶激活工藝及蛋白酶活力的測定

取冷凍豬胰臟于室溫條件解凍0.5～1 h，切塊后置于勻漿機中攪碎成胰漿。加胰漿重量1.5倍體積(mL)的預(yù)冷的25%酒精攪勻，添加胰漿重量0.2%的CaCl2，胰漿重量0.5%的胰酶粉作為激活劑；胰漿重量0.5%的NaCl，胰漿重量0.5%的土豆淀粉或可溶性淀粉作為保護(hù)劑。攪勻后調(diào)pH至 5.5，置于4℃條件下激活 48 h。激活后胰漿用雙層紗布過濾，濾液即為粗酶液，低溫保存待用。

取激活的胰漿5.00 g置于研缽內(nèi)，加少量pH 6.0 氯化鈣溶液研磨均勻，繼續(xù)加氯化鈣溶液定容至50 mL，取2 mL 加 pH為7.5的硼酸緩沖液定容至50 mL，從中吸取1 mL加pH為7.5的硼酸緩沖液定容至10 mL，即為稀釋后酶液，按照中華人民共和國藥典 2015 版第二部胰蛋白酶效價測定方法測定，得到胰蛋白酶活力為405 U/g 激活后胰漿。

2.2 酶解魚溶漿工藝條件的選擇及優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 液料比對魚溶漿酶解的影響 在加酶量為14%，40℃條件下酶解4 h，根據(jù)水解后酸溶蛋白含量確定適宜的液料比，結(jié)果見圖1。由圖1可知，增大加水量，酸溶蛋白含量剛開始呈現(xiàn)上升趨勢，但液料比大于2.5∶1時，隨著加水量的增大，底物濃度降低，酶解效果下降，酸溶蛋白含量顯著降低。因此初步確定酶解的液料比為2.5:1。

圖1 液料比對魚溶漿酶解的影響 圖2 酶解溫度對魚溶漿酶解的影響

2.2.1.2 溫度對魚溶漿酶解的影響 在液料比為2.5:1，加酶量為14%，分別控制溫度為35、40、45、50、55℃條件下酶解4 h，根據(jù)水解后酸溶蛋白含量確定適宜酶解溫度，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，酸溶蛋白含量呈上升趨勢，但溫度超過45℃后，隨著溫度的升高，酶活力下降，酸溶蛋白含量呈下降趨勢。因此選擇酶解的溫度為40℃。

2.2.1.3 加酶量對魚溶漿酶解的影響 控制液料比為2.5:1，酶解溫度40℃，按照表1中的加酶量分別添加激活胰酶液酶解4 h，根據(jù)水解后酸溶蛋白含量確定最適加酶量，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著加酶量的增大，酸溶蛋白含量呈上升趨勢，但加酶量達(dá)到一定后，繼續(xù)增大加酶量，酸溶蛋白含量呈上升不明顯?？赡苁怯捎诿傅孜餄舛冗_(dá)到一定比值，再增加酶含量難以促進(jìn)水解反應(yīng)。因此初步確定加酶量為14%。

圖3 加酶量對魚溶漿酶解的影響 圖4 pH對魚溶漿酶解的影響

2.2.1.4 酶解pH對酸溶蛋白含量的影響 控制液料比為2.5：1，酶解溫度40℃，加酶量為14%，按照表1中的pH分別酶解4 h，根據(jù)水解后酸溶蛋白含量確定最適pH，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著pH的增大，魚溶漿水解后的酸溶蛋白含量有顯著上升，在pH為8時可以達(dá)到最高，隨著pH繼續(xù)增大，水解效果沒有明顯變化，當(dāng)pH為9時，由于此時pH已不在胰酶最適pH范圍內(nèi)，因此初步確定水解的pH 為8.0。

圖5 酶解時間對魚溶漿酶解的影響

2.2.1.5 酶解時間對魚溶漿的影響 控制液料比為2.5：1，加酶量為14%，酶解溫度為40℃，按照表1中的設(shè)定不同的酶解時間，根據(jù)水解后酸溶蛋白含量確定最適酶解時間，結(jié)果見圖5。由圖5可知隨著酶解時間的增加，水解后酸溶蛋白含量逐漸增加，但當(dāng)水解時間超過4 h后，酸溶蛋白含量增長緩慢，可能是由于魚溶漿被不斷水解，底物濃度下降，產(chǎn)物濃度增大，對酶活性抑制性增強。故初步確定酶解時間為4 h。

2.2.2 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝 在單因素試

驗的基礎(chǔ)上，選取對酶解魚溶漿后的酸溶蛋白含量影響較顯著的液料比、加酶量、酶解溫度與時間進(jìn)行Box-behnken 響應(yīng)面設(shè)計試驗，以酶解液的酸溶蛋白含量為指標(biāo)，以期獲得最佳的酶解條件。試驗因素水平設(shè)計見表 2，具體試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表2 酶解魚溶漿響應(yīng)面分析法因素水平表

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

續(xù)表

運用Design Expert8.0.6軟件對上述結(jié)果進(jìn)行整理分析，經(jīng)回歸擬合后，獲得如下回歸方程預(yù)測模型：

Y=37.06+2.35A+2.69B-0.19C+0.67D+0.25AB+0.1AC+0.50AD+0.68BC+0.25CD-1.76A2-4.57B2-4.42 C2-2.21D2

表4 回歸模型方差分析

由表4可知，根據(jù)回歸方差分析顯著性檢驗，該模型回歸極顯著(P<0.0001)，失擬項不顯著(P>0.05)。模型的相關(guān)系數(shù)為0.9922，調(diào)整復(fù)相關(guān)指數(shù)為0.9843。因而該模型擬合程度很好，實驗誤差小，歸方程可較好地描述各因素對魚溶漿酶解效果的影響，可預(yù)測在不同酶解條件下酸溶蛋白的得率。由F值可以看出，以酸溶蛋白含量為響應(yīng)值影響酶解的因素從大到小依次為：加酶量>液料比>酶解時間>酶解溫度。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化 為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用以及確定最優(yōu)點，繪制響應(yīng)面曲線圖進(jìn)行直觀分析。將沒有顯著性影響的自變量設(shè)為零，觀察具有顯著性因素間的交互作用。

固定水平：酶解溫度45℃；酶解時間4 h。 固定水平：加酶量14%；酶解溫度45℃。

由圖6可以看出，隨著加酶量(B)的提高，所得酶解液的酸溶蛋白含量隨之增大，當(dāng)加酶量大于14%時，酸溶蛋白含量增長緩慢。同時，在液料比(A)為2.6：1～3：1時所得酸溶蛋白含量較高。因此可得酶解的優(yōu)化條件是：液料比為2.6:1～3:1，加酶量為14～15%。

由圖7可以看出，隨著酶解時間(C)的增大，所得酶解液的酸溶蛋白含量升高，當(dāng)酶解時間超過4h后，酸溶蛋白含量增長緩慢。同時，在液料比(A)為2.6：1～3：1時所得酸溶蛋白含量較高。因此可得酶解的優(yōu)化條件是：液料比為2.6:1～3:1，酶解時間為4～4.5 h。

固定水平：液料比2.5:1；酶解溫度45℃。

由圖8可以看出，隨著加酶量(B)的增大，所得酶解液的酸溶蛋白含量隨之增大，當(dāng)加酶量大于14%時，酸溶蛋白含量增長緩慢。同時，當(dāng)酶解時間超過4 h后，酸溶蛋白含量增長緩慢。因此可得酶解的優(yōu)化條件是：加酶量為14%～15%，酶解時間為4～4.5 h。

為了進(jìn)一步確證酶解的最佳條件，分別對回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零并整理，得到以酸溶蛋白含量為指標(biāo)的最佳工藝：液料比2.8∶1、加酶量14.6%、酶解溫度45.1℃、酶解時間4.3 h。

2.2.4 驗證性實驗 為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，采用上述優(yōu)化后的工藝條件進(jìn)行魚溶漿酶解實驗，實驗重復(fù)3次，測得水解液中的酸溶蛋白含量平均值為38.0%。實驗值與模型計算值(38.3%)的相對誤差僅為-0.78%，說明采用響應(yīng)面優(yōu)化得到的制曲工藝條件參數(shù)準(zhǔn)確。

3 結(jié)論

利用胰臟激活后的胰酶液作為酶制劑對魚溶漿水解，在確定酶解pH為8.0的條件下，以酸溶蛋白含量為響應(yīng)指標(biāo)，利用實驗設(shè)計軟件Design-Expert通過4因素3水平Box-Behnken響應(yīng)面分析法得出了其最佳酶解工藝條件：液料比2.8∶1、加酶量14.6%、酶解溫度45.1℃、酶解時間4.3 h；在此條件下，魚溶漿酶解液中酸溶蛋白含量可達(dá)38.0%，試驗結(jié)果與最佳理論條件下所得結(jié)果基本一致。