北極狐Wnt3a基因CDS區(qū)克隆及生物信息學(xué)分析

王瑞寧，周瑞紅，趙子雅，馮碩，李可強(qiáng)，彭永東，李祥龍

(河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北 秦皇島 066004)

北極狐(Vulpeslagopus)絨毛稠密豐厚，針毛挺拔柔軟，毛皮板質(zhì)薄而結(jié)實(shí)并富有彈性，御寒力強(qiáng)，雍容高雅，號(hào)稱(chēng)“軟黃金”。狐皮目前已經(jīng)成為國(guó)際裘皮貿(mào)易的三大支柱產(chǎn)品之一，是制裘工業(yè)的高檔原料，在毛皮動(dòng)物產(chǎn)業(yè)中占有舉足輕重的地位。北極狐作為重要的毛皮動(dòng)物，其毛色豐富，是開(kāi)展動(dòng)物毛色研究的最佳材料，其中毛色作為影響狐皮品質(zhì)最重要的性狀之一，是狐皮經(jīng)濟(jì)價(jià)值關(guān)鍵因素[1]。

Wnt家族成員3a(wingless-type MMTV integration site family, member 3a，Wnt3a)是Wnt家族的重要成員之一，通過(guò)經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及控制細(xì)胞的定位等過(guò)程[2]。Wnt3a在黑素細(xì)胞的發(fā)育中起著重要的作用，它可以促進(jìn)神經(jīng)嵴細(xì)胞向色素細(xì)胞發(fā)育，如果缺乏Wnt3a和Wnt1這2種蛋白，神經(jīng)嵴細(xì)胞就會(huì)發(fā)育成神經(jīng)元細(xì)胞而不是黑素細(xì)胞[3]。Wnt3a對(duì)黑色素細(xì)胞的分化也起到了調(diào)控作用，它可以促進(jìn)小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)黑素母細(xì)胞分化成黑色素細(xì)胞[4]。Guo等[5]也發(fā)現(xiàn)，Wnt3a通過(guò)上調(diào)MITF及其下游基因酪氨酸酶和酪氨酸相關(guān)蛋白1(TRP1)，在降低黑色素細(xì)胞增殖的同時(shí)，增加黑色素合成。Wnt蛋白對(duì)黑色素的調(diào)控作用一般是通過(guò)結(jié)合細(xì)胞膜上的脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP-5/6)和卷曲蛋白(frizzled)受體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。它們形成的復(fù)合物活化胞內(nèi)的散亂蛋白(dishevelled)，進(jìn)而抑制糖原合成酶激酶-β(GSK-β)的活性，增加胞漿內(nèi)具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的β-catenin的量，β-catenin聚集后結(jié)合TCF/LEF家族蛋白形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，再與MITF基因的啟動(dòng)子結(jié)合，從而激活MITF基因的表達(dá)，參與黑色素細(xì)胞的分化、黑色素生成等[6-7]。在不同毛色的羊駝皮膚組織中，Wnt3a的表達(dá)量也具有顯著差異[8]。除此之外，Wnt3a基因及其相關(guān)信號(hào)通路與多種疾病的發(fā)生相關(guān)，如先天性巨結(jié)腸病、結(jié)腸癌、肝癌、慢性牙周炎等[9-12]。因此對(duì)于Wnt3a基因及其相關(guān)信號(hào)通路的研究近幾年成為熱點(diǎn)。

關(guān)于北極狐Wnt3a基因和Wnt3a基因的生物信息學(xué)分析有關(guān)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，而本研究利用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(RT-PCR)，成功擴(kuò)增了北極狐Wnt3a基因CDS區(qū)序列，然后構(gòu)建到了pMD 18-T載體中，并對(duì)北極狐Wnt3a基因CDS區(qū)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為今后北極狐毛色調(diào)控機(jī)制和Wnt3a基因及相關(guān)信號(hào)通路的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

北極狐為河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院飼養(yǎng)，240日齡時(shí)，選擇雄性北極狐屠宰后迅速取背部皮膚組織，液氮凍存30 min后，存放于-80 ℃冰箱中。

試驗(yàn)用到的反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMDTM18-T Vector Cloning Kit、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、DNA Marker、氨芐青霉素購(gòu)自TaKaRa公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自博邁德生物有限公司；胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂糖、TRIzol試劑購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；2×EsTaqMasterMix(Dye)購(gòu)于康為世紀(jì)生物有限公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 北極狐皮膚組織總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

取北極狐皮膚組織，按照TRIzol法提取總RNA，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，并用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，以O(shè)ligo(dT)為引物，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后存放于-70 ℃冰箱保存。

1.2.2 Wnt3a基因CDS區(qū)的擴(kuò)增

從NCBI中找到了與北極狐同為犬科的澳洲野狗Wnt3a基因cDNA的序列(登錄號(hào)XM_025454916.1)，利用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。上游引物(F)為：5′-CGGTGCTCTCGGGGTGGAC-3′，下游引物(R)為：5′-CGCGCTACTTGCAGGTGT-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為1 112 bp。引物交由北京華大基因有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為50 μL：PrimeSTAR Max DNA Premix(2×)25 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火8 s，72 ℃延伸10 s，共33個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min；12 ℃保存。之后將所有PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段。

1.2.3 目的片段的克隆與鑒定

由于PCR擴(kuò)增片段為平末端，構(gòu)建至pMD18-T載體時(shí)，需要先對(duì)片段末端加A，具體方法為：取PCR回收產(chǎn)物24.9 μL，加入TaqDNA聚合酶0.6 μL，dNTPs 1.5 μL，10×PCR Buffer 3 μL，放在PCR儀中72 ℃修飾15 min。然后將產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段。將目的片段與pMD18-T載體于PCR儀中16 ℃連接1 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃搖床培養(yǎng)1.5 h。之后，取100 μL菌液涂在含有Amp的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取白色單菌落于1.5 mL離心管中，加入1 mL LB液體培養(yǎng)基(含Amp)，37 ℃搖床培養(yǎng)5 h后，進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×EsTaqMasterMix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，菌液1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共33個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min；12 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，陽(yáng)性菌液送北京華大基因有限公司測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用NCBI中OFR Finder程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)對(duì)北極狐Wnt3a基因核苷酸序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框分析；利用Protparam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)、Protscale(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；利用GOR4(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)、SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；使用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)；利用PSORT Ⅱ(https://psort.hgc.jp/form2.html)分析蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位；利用NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對(duì)蛋白質(zhì)信號(hào)肽進(jìn)行分析；除了澳洲野犬外，又從NCBI中找到了家犬(XM_539327.5)、綿羊(XM_027969327.1)、人(XM_011544319.3)、小鼠(NM_009522.2)、馬(XM_023618338.1)、雞(NM_001171601.1)、雪貂(XM_003123621.4)的Wnt3a基因序列，利用MegAlign和MEGA 7軟件進(jìn)行同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 Wnt3a基因克隆載體的構(gòu)建

取北極狐Wnt3a基因PCR產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)目的條帶大小與之前預(yù)測(cè)的1 112 bp的大小相吻合(圖1A)。通過(guò)切膠回收和末端修飾后，構(gòu)建至pMD18-T載體，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后挑取單菌落進(jìn)行PCR，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1B)，選擇陽(yáng)性菌液送公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接校正后，獲得了北極狐Wnt3a基因完整的CDS區(qū)序列(圖2)。

M.DL2000 DNA Marker；1.Wnt3a基因

圖2 北極狐Wnt3a基因核酸及氨基酸序列

2.2 北極狐Wnt3a基因核苷酸序列及氨基酸序列分析

利用NCBI中的ORF Finder對(duì)測(cè)序得到的北極狐Wnt3a基因核苷酸序列進(jìn)行了開(kāi)放閱讀框分析，得到了1條1 059 bp的ORF，其起始密碼子位于第49位，終止密碼子位于1 107位，共計(jì)編碼352個(gè)氨基酸。通過(guò)DNAman對(duì)序列分析發(fā)現(xiàn)，其核苷酸序列A、T、C、G含量分別為17.9%、16.4%、33.8%、31.8%。其編碼氨基酸組成及比例如表1所示，北極狐Wnt3a基因編碼蛋白由20種氨基酸組成，其中絲氨酸含量最高，達(dá)到9.09%。

表1 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白氨基酸組成

2.3 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白理化性質(zhì)分析

利用ProtParam在線工具對(duì)北極狐Wnt3a基因編碼蛋白進(jìn)行分析，得出其分子式為C1714H2626N506O506S31，相對(duì)分子質(zhì)量為39 410.65，等電點(diǎn)為8.26，說(shuō)明該蛋白為堿性蛋白質(zhì)。當(dāng)該蛋白所有的半胱氨酸殘基形成半胱氨酸時(shí)，其消光系數(shù)為68 880 mol/mL，對(duì)應(yīng)的吸光值為1.748；當(dāng)該蛋白所有的半胱氨酸殘基不能形成半胱氨酸時(shí)，其消光系數(shù)為67 380 mol/mL，對(duì)應(yīng)的吸光值為1.710。在哺乳動(dòng)物的網(wǎng)狀紅細(xì)胞中，該蛋白的半衰期為30 h。不穩(wěn)定系數(shù)為50.26，說(shuō)明該蛋白不穩(wěn)定。脂溶指數(shù)為61.53，總平均親水性(GRAVY)為-0.385，說(shuō)明該蛋白為親水性蛋白。該蛋白親水性分析如圖3所示，北極狐Wnt3a蛋白大部分氨基酸均屬于親水性氨基酸，因此總體顯示出親水性。

圖3 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白親水性分析

2.4 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

利用GOR4在線分析工具對(duì)北極狐Wnt3a基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，得出其二級(jí)結(jié)構(gòu)中大部分為無(wú)規(guī)卷曲，占比為51.7%，其次為β-片層和α-折疊，占比分別為27.56%和20.74%，且不存在其他二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖略)。使用SWISS-MODEL在線建模工具對(duì)北極狐Wnt3a蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，其主體結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，與二級(jí)結(jié)構(gòu)中預(yù)測(cè)到的存在大量的無(wú)規(guī)卷曲結(jié)果相一致(圖略)。

2.5 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)與亞細(xì)胞定位分析

利用TMHMM在線分析工具對(duì)北極狐Wnt3a基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白所有氨基酸均位于膜外(圖4)，所以推測(cè)該蛋白屬于膜外蛋白。通過(guò)使用PSORTⅡ?qū)Ρ睒O狐Wnt3a基因編碼蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，預(yù)測(cè)出該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞膜外、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞骨架中，其占比分別為：30.4%、21.7%、21.7%、8.7%、8.7%、8.7%。

圖4 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析

2.6 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白磷酸化和信號(hào)肽分析

通過(guò)使用NetPhos 3.1 Server在線工具對(duì)北極狐Wnt3a基因氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)分析(圖5)，發(fā)現(xiàn)其中有22個(gè)絲氨酸、6個(gè)蘇氨酸、5個(gè)酪氨酸位點(diǎn)的預(yù)測(cè)值超過(guò)了臨界值。

圖5 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

利用SignalP 4.1在線工具對(duì)北極狐Wnt3a基因編碼蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行了分析(圖6)，從第19個(gè)氨基酸位點(diǎn)開(kāi)始，之后的氨基酸的C值、Y值、S值突然降低，然后趨于平緩，推測(cè)該蛋白可能存在信號(hào)肽，且信號(hào)肽位于1～19位氨基酸位點(diǎn)，其切割位點(diǎn)位于第19個(gè)氨基酸處。

圖6 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白信號(hào)肽分析

2.7 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白同源性與系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了澳洲野犬、家犬、綿羊、人等9個(gè)物種的Wnt3a基因的mRNA序列，利用MegAlign和MEGA 7軟件對(duì)北極狐和這9個(gè)物種進(jìn)行了Wnt3a基因的同源性分析(表2)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建(圖7)。從同源性分析來(lái)看，在這9個(gè)物種中，與北極狐親緣關(guān)系最近的是澳洲野犬，其相似度達(dá)到了99.7%，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是原雞，其相似度為75.2%。除此之外，家犬、綿羊、人、小鼠、馬、野豬、雪貂與北極狐的Wnt3a基因的相似度都在85%以上，由此可以得出Wnt3a基因具有較好的保守性。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)看，各物種間的親緣關(guān)系與物種分類(lèi)基本一致，與北極狐進(jìn)化關(guān)系最近的為澳洲野犬，其次為家犬，且它們同屬犬科；它們又與雪貂、野豬、綿羊、馬、人、小鼠同為一類(lèi)，它們同屬于哺乳動(dòng)物；而原雞作為卵生動(dòng)物，與北極狐的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。

表2 10個(gè)物種Wnt3a基因同源性分析

圖7 10個(gè)物種Wnt3a基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

近年來(lái)關(guān)于Wnt信號(hào)通路的研究成為一個(gè)熱門(mén)，其中的Wnt家族是一類(lèi)富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白，目前在人類(lèi)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了該家族的成員19種，它們通過(guò)與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)及其特異性受體卷曲蛋白相互作用，激活下游的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[13]。Wnt3a所在的Wnt/β-catenin通路是經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，是目前為止研究最多的Wnt信號(hào)通路[14]。Wnt3a除了與黑色素的生成有關(guān)外，還與包括癌癥在內(nèi)的許多疾病的病因?qū)W和病理學(xué)密切相關(guān)[15-16]。目前關(guān)于Wnt3a基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)通過(guò)利用RT-PCR的方法，成功克隆了北極狐Wnt3a基因，并經(jīng)過(guò)測(cè)序分析得到了其完整的CDS區(qū)序列，其包含1 059個(gè)堿基，編碼352個(gè)氨基酸，其數(shù)量與NCBI中家犬和人的Wnt3a蛋白氨基酸含量存在差異。對(duì)其理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白為堿性且不穩(wěn)定的親水性蛋白。對(duì)北極狐Wnt3a蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，其中間存在著大量的無(wú)規(guī)卷曲，占比達(dá)到了51.7%，使得其三級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)。

通過(guò)進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，北極狐Wnt3a蛋白屬于膜外蛋白，其主要定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體中，與已往研究發(fā)現(xiàn)的Wnt3a蛋白作為一種分泌蛋白可以調(diào)控多種基因表達(dá)的說(shuō)法一致[17]。磷酸化是蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)的重要機(jī)制，在蛋白質(zhì)功能和活力的控制和調(diào)節(jié)中具有重要作用[18]。北極狐Wnt3a蛋白中存在33個(gè)蛋白磷酸化位點(diǎn)超過(guò)臨界值，說(shuō)明這些位點(diǎn)可能會(huì)成為蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)[8]。信號(hào)肽序列的作用是把蛋白質(zhì)引導(dǎo)到細(xì)胞含不同膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞器內(nèi)[19]。在利用SignalP進(jìn)行信號(hào)肽分析時(shí)，C值越高表示剪切位點(diǎn)的可能性越大，Y值最高點(diǎn)常作為最佳剪切位點(diǎn)，S值的低分和高分位置分別表示氨基酸位于成熟蛋白部位和信號(hào)肽部位[20]。北極狐Wnt3a蛋白蛋白存在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，位于1～19位氨基酸位點(diǎn)，切割位點(diǎn)位于第19個(gè)氨基酸處。從同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析來(lái)看，在北極狐與澳洲野犬、家犬、綿羊、人等9個(gè)物種的Wnt3a基因序列比較中，同樣作為犬科的澳洲野犬和家犬與北極狐親緣關(guān)系較近，且與其他幾個(gè)哺乳動(dòng)物的同源性均達(dá)到了85%以上，而與卵生動(dòng)物原雞親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，但也存在75.2%的同源性，由此說(shuō)明了Wnt3a基因保守性較好，但是在哺乳動(dòng)物和卵生動(dòng)物之間可能存在較大的差異。

綜上所述，本研究成功克隆了北極狐Wnt3a基因的CDS區(qū)序列，并對(duì)其核苷酸和編碼氨基酸序列成分、理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，同時(shí)還利用生物信息學(xué)的方法對(duì)北極狐Wnt3a基因編碼蛋白進(jìn)行了二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、磷酸化位點(diǎn)、信號(hào)肽以及與其他8個(gè)物種間同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析，為今后研究Wnt3a基因及相關(guān)通路提供了重要參考。