HPLC法測定清熱解毒口服液中哈巴俄苷的含量*

毛群芳，鐘湘云，褚思思，邱艷明，劉穎新

(湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南 株洲 412000)

清熱解毒口服液是由石膏、金銀花、玄參、地黃、連翹、梔子、黃芩等12味中藥組成的復(fù)方制劑，具有清熱解毒的功效。用于熱毒壅盛所致的發(fā)熱面赤、煩躁口渴、喉嚨腫痛；流感、上呼吸道感染見上述證候者[1]?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《中國藥典》2015年版一部。該標(biāo)準(zhǔn)中，僅對黃芩苷進行了含量測定。但處方中成份較多，方中綠原酸、連翹苷、梔子苷等成份的含量測定早有文獻報道[2-6]。而方中玄參的主成分哈巴俄苷的測定罕見報道。故本研究針對清熱解毒口服液中哈巴俄苷的含量進行測定。本實驗采用高效液相色譜法測定清熱解毒口服液中哈巴俄苷的含量，為清熱解毒口服液的質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀 器

LC-20A型高效液相色譜儀(包括二元高壓輸液泵、全自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器)，日本島津公司；CPA225D型電子分析天平，德國賽多利斯；KQ-100B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UPK-I-10T型超純水機，成都優(yōu)越科技有限公司。

1.2 試 藥

清熱解毒口服液(批號1902014、1902015、1902016)，輔仁藥業(yè)集團有限公司；哈巴俄苷對照品(批號：C100560)，貴州迪大科技有限公司；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫：0～10 min 97%～90% B，10～20 min 90%～67% B，20～25 min 67%～60% B，25～30 min 60%～50% B，30～35 min 50%～20% B，40 min 20% B，40～42 min 20%～97% B；檢測波長：278 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流速：1 mL·min-1。

2.2 溶液的制備

(1)對照品溶液的制備：精密稱取哈巴俄苷對照品適量，加30%甲醇溶解并定容至刻度，制成后每mL含哈巴俄苷61.2 μg。

(2)供試品溶液的制備：精密量取清熱解毒口服液5 mL，至25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容至刻度。

2.3 陰性對照試驗

按照《中國藥典》2015年版一部中該藥的處方比例和制備方法，制成不含玄參的樣品溶液，按“2.2.2”項下的方法制成陰性對照溶液。按照“2.1”項下的色譜條件，注入高效液相色譜儀。陰性對照溶液的色譜圖中，在與哈巴俄苷色譜峰對應(yīng)的位置上，無干擾峰出現(xiàn)。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

在“2.1”項中的色譜條件下，分別測定哈巴俄苷對照品溶液和供試品溶液，記錄色譜圖。哈巴俄苷色譜峰的理論板數(shù)不低于5000，分離度大于1.5。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項下的對照品溶液2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、20 μL，依次注入液相色譜儀，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，分別記錄哈巴俄苷色譜峰的峰面積，并計算其含量。以哈巴俄苷含量(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，得出回歸方程：Y=15508X+29816，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，表明哈巴俄苷在12.24～122.4 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測定。結(jié)果其峰面積RSD為0.72%，表明此方法下，儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密量取清熱解毒口服液(批號：1902014)適量，按照“2.2.2”項下方法制得供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、12、24 h按“2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果其峰面積RSD為1.14%，表明供試品溶液24 h內(nèi)在室溫下穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

分別精密量取同一批號清熱解毒口服液(批號：1902014)適量，按照“2.2.2”項下方法制得6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果其峰面積RSD為1.36%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收試驗

精密量取清熱解毒口服液(批號：1902014)5 mL，共6份，至25 mL容量瓶中，分別精密加入一定量的對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制得供試品溶液，測定峰面積，計算回收率。平均回收率為99.52%，RSD為1.10%。

2.10 樣品測定

表1 清熱解毒口服液中哈巴俄苷的含量測定結(jié)果表Table 1 Determination of Harpagoside in Qingrejiedu oral liquid

取3批樣品，依法制得供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定并計算哈巴俄苷的含量，結(jié)果見表1。

3 結(jié) 論

通過DAD掃描得出哈巴俄苷的最大吸收波長為278 nm，故將此波長設(shè)定為測定波長。

哈巴俄苷在結(jié)構(gòu)上屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物，易溶于甲醇。查閱《中國藥典》及相關(guān)文獻，哈巴俄苷通常使用甲醇進行提取[7-8]。故本實驗采用甲醇溶液提取制備供試品溶液。對提取溶劑的濃度進行選擇時發(fā)現(xiàn)，用50%甲醇溶液提取樣品，雜質(zhì)干擾較小，哈巴俄苷含量較高。因此選用50%甲醇溶液作為樣品的提取溶劑。

哈巴俄苷具有一定的酸性，流動相中加入適當(dāng)比例的酸，能改變峰形，有助于哈巴俄苷與干擾峰的分離。而實驗中發(fā)現(xiàn)，甲醇-磷酸水系統(tǒng)的洗脫能力相對較弱，待測峰不能獲得很好的分離。故采用乙腈-磷酸水梯度洗脫系統(tǒng)。

本實驗所建立的高效液相色譜法，操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性較好，可用于清熱解毒口服液中哈巴俄苷的含量測定，為清熱解毒口服液的質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。