新發(fā)8p 重復(fù)伴缺失綜合征患兒細(xì)胞分子遺傳學(xué)研究

劉芙蓉 郝勝菊 張 釧 周秉博 王 興 鄭 雷

甘肅省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)中心 甘肅省出生缺陷防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（甘肅蘭州 730050）

8號染色體短臂倒位重復(fù)伴末端缺失，即inv dup del（8p），是一種復(fù)雜的染色體質(zhì)量組，目前報道新生兒中發(fā)病率為1/(10000～30000)[1]。2010年國內(nèi)報道首例明確診斷病例[2]。此類患者共同的臨床表征為智力障礙、腦部結(jié)構(gòu)異常、特殊面容及先天性心臟病[3-6]。本文通過對1 例臨床表型相似患兒的細(xì)胞分子遺傳學(xué)分析，結(jié)合多種檢測技術(shù)相互驗(yàn)證，明確病因，為臨床診斷、預(yù)后評估及針對性遺傳咨詢提供有效依據(jù)。

1 臨床資料

患兒，女，足月順產(chǎn)，G2P1，出生體質(zhì)量3 110g，無搶救史及異常出生史。6 月齡時于甘肅省婦幼保健院首次就診?；純壕驮\時體質(zhì)量5.7 kg，身長64 cm，頭圍42.5 cm；面容異常，圓臉、高前額、眼球略凸出、睡覺不能閉眼、顳部收縮、鼻寬、鼻孔朝天、腭弓較高、人中長、下頜較?。粚ν饨绱碳し磻?yīng)緩慢，表情呆滯，少哭鬧；俯臥位抬頭＜90°，四肢肌張力低下，特發(fā)性肌張力異常。心臟彩超提示：主動脈弓中斷，室間隔缺損，房間隔缺損，動脈導(dǎo)管未閉。喉鏡檢查示：喉軟化癥。頭顱CT平掃未見明顯異常。

根據(jù)患兒臨床表現(xiàn)，經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理審查，患兒雙親知情同意后，采集患兒及雙親外周血，行細(xì)胞培養(yǎng)、染色體制備、G顯帶及染色體核型分析。結(jié)果顯示，當(dāng)分辨率在400 條帶水平時，所有分裂相8 號染色體短臂8p21處增加一段不明來源的染色體物質(zhì)，8號染色體短臂末端8p23處缺失條帶，分析確定為8p臂內(nèi)倒位所致的重復(fù)和缺失，但具體斷裂點(diǎn)于當(dāng)前分辨率下不易確定，見圖1?；純喝旧w核型為：46，XX，der（8）inv dup（8）（p21），del（8）（p23）患兒父母外周血染色體G顯帶核型分析均無異常。

圖1 染色體G 顯帶核型分析結(jié)果

使用QIAGEN 公司的基因組DNA 提取試劑盒，按照試劑盒說明書提取基因組DNA。Nanodrop2000核酸定量儀測定DNA 純度和濃度。DNA 濃度范圍為50～250 ng/μL。－20℃保存。將已構(gòu)建的DNA文庫在Illumina NextSeq500測序平臺上機(jī)測序，最小精度為100 kb，測序深度為1 X。將高通量測序結(jié)果經(jīng)信息分析，每個測序Reads匹配到其所在的染色體上作相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化Z值分析,通過Z值進(jìn)行染色體異常判定。通過檢索DECIPHER，OMIM，ClinGen，ClinVar，DGV等數(shù)據(jù)庫確定CNV 的臨床意義。選取斷裂位點(diǎn)交界處基因，設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物有限公司合成，檢測位點(diǎn)序列及產(chǎn)物片段見表1。高通量測序全基因組拷貝數(shù)變異分析檢出患兒8號染色體短臂存在100Kb以上已知的、明確致病基因組的拷貝數(shù)變異（CNV），其中在8p23.3-p23.1（160 001～7 120 000）區(qū)域，缺失6.96 Mb片段；在8p23.1-p21.1（12 560 001-27 940 000）區(qū)域，重復(fù)15.38 Mb片段，見圖2。查閱文獻(xiàn)，8p23.2-pter缺失患者主要的臨床表征為智力障礙，發(fā)育遲緩,心臟異常等[6-7]；8p22-8p23.1重復(fù)患者主要的臨床癥狀為顱面畸形，特殊面容，骨骼、神經(jīng)系統(tǒng)、心臟及泌尿生殖系統(tǒng)異常等[8-10]。

圖2 高通量測序全基因組拷貝數(shù)變異分析結(jié)果

進(jìn)一步以熒光定量PCR 檢測技術(shù)驗(yàn)證CNV 結(jié)果。選取拷貝數(shù)變化區(qū)域的交界處，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增驗(yàn)證。用GAPDH基因位點(diǎn)做內(nèi)參，檢測8p23.3-p23.1區(qū)域內(nèi)基因組位置為6.90 Mb 的DEFA 5 和7.2 Mb的ZNF 705 G 基因位點(diǎn)拷貝數(shù)。PCR 反應(yīng)總體系為20 μL，其中加入DNA模板40 ng，上下游引物各40 pmol，SYBR Green PCR Master2×預(yù)混液 10 μL。反應(yīng)條件：37℃預(yù)變性5分鐘，95℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性15秒，60℃延伸1分鐘，共40個循環(huán)。利用ABI公司Quant Studio DX熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測。數(shù)據(jù)分析以正常對照樣本的待檢基因和內(nèi)參基因?yàn)榛鶞?zhǔn)進(jìn)行校正，得出檢測樣本中待測基因和內(nèi)參基因拷貝數(shù)比值的相對變化2-ΔΔCt[11]。靶序列體外PCR擴(kuò)增時,熒光信號到達(dá)設(shè)定域值所需的循環(huán)數(shù)為Ct值；同一樣本（先證者/正常對照）中擴(kuò)增待檢基因與內(nèi)參基因的Ct差值為ΔCt；而待檢樣本與正常對照樣本間ΔCt的差值為ΔΔCt。因此，正常對照樣本的基因組拷貝數(shù)為2n，若檢測樣本基因拷貝數(shù)為1n則表示缺失1個拷貝，2n為拷貝數(shù)正常，3n為增加1個拷貝，相應(yīng)的預(yù)期的2-ΔΔCt分別為0.5、1.0和1.5。結(jié)果顯示，患兒與正常對照樣本的比值分別為0.52和1.03，說明患兒上述位點(diǎn)的基因組拷貝數(shù)分別為缺失1個拷貝和無拷貝數(shù)變化。檢測8p23.1-p22區(qū)域內(nèi)基因組位置為12.3 Mb的FAM86B2和12.6 Mb的LONRF1的基因位點(diǎn)拷貝數(shù)，患兒與正常對照樣本的比值分別為1.04和1.59，患兒上述相應(yīng)位點(diǎn)的基因組拷貝數(shù)分別為無拷貝數(shù)變化和增加1個拷貝。檢測8p21.1區(qū)域內(nèi)基因組位置為27.6 Mb的ESCO2和28.2 Mb的PNOC基因位點(diǎn)拷貝數(shù)，患兒與正常對照樣本的比值分別為1.51 和0.99，患兒上述相應(yīng)位點(diǎn)的基因組拷貝數(shù)分別為增加1個拷貝和無拷貝數(shù)變化。熒光定量PCR與CNV檢測結(jié)果一致，據(jù)此可確定染色體核型分析結(jié)果為，46，XX，der（8）inv dup（8）（p21.1-p23.1），del（8）（p23.1-p23.3）。

表1 熒光定量PCR檢測位點(diǎn)各引物序列及產(chǎn)物片段長度

2 討論

8 號染色體短臂的重復(fù)缺失絕大多數(shù)是倒置所致，其主要臨床特征為：顱面畸形、特殊面容，如圓臉、前額突出、鼻梁塌、眼角下斜、高腭弓、小下頜、耳位及耳旋轉(zhuǎn)度異常等，大腦結(jié)構(gòu)異常，如胝體缺如、腦發(fā)育不全等，生長發(fā)育遲緩、智力發(fā)育落后，肌張力異常。另外，常可并發(fā)心臟異常，如卵圓孔未閉、右位心、動脈導(dǎo)管未閉、房室間隔缺損及法洛四聯(lián)癥等，骨骼異常及泌尿生殖系統(tǒng)異常等[12-15]。本例患兒的圓臉、高前額、鼻寬、小下頜等均與報道表型相符；與同齡正常兒童生長發(fā)育水平相比，患兒身長、體質(zhì)量落后，且智力發(fā)育遲緩；特發(fā)性肌張力異常；并發(fā)房間隔缺損；雖頭顱CT結(jié)果示大腦結(jié)構(gòu)正常，但并未排除功能是否如常，仍有待進(jìn)一步隨訪觀察。綜合患兒的上述各表型均符合inv dup del（8p）綜合征的典型臨床癥狀。

隨著分子遺傳學(xué)診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步，對inv dup del（8p）綜合征的研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)不同患者其8p末端缺失的片段完全一致，而倒位重復(fù)的片段則因雙著絲粒中間體的斷裂位點(diǎn)不同，致使近端斷裂點(diǎn)各有不同[2]。有報道單純8 p 末端缺失患者有圓臉、面頰飽滿、突前額、耳位/耳廓異常、小下頜及先天性心臟病等臨床表型特征，與inv dup del（8p）綜合征臨床表型相似[7]。因此8p23.1-8pter上相關(guān)基因的缺失導(dǎo)致出現(xiàn)inv dup（8p）綜合征的特征性面容。本例患兒8p23.1至8p末端缺失，其特殊面容與報道相符，且心臟發(fā)育異常，提示單純8p缺失其表型與8p重復(fù)伴缺失的表型類似。

研究顯示，8p三體常伴胼胝體發(fā)育不良，且8p22-8p23.1片段重復(fù)導(dǎo)致胼胝體缺如、腦室擴(kuò)張、腦發(fā)育不全等表型[16]。也有報道8p12-8p23.3倒位重復(fù)患兒，伴有顯著的運(yùn)動發(fā)育遲緩、肌張力減退、自閉癥、面部畸形、室間隔缺損及胼胝體發(fā)育不良[17]。本例患兒重復(fù)片段包含至上述報道的區(qū)域內(nèi)，其面容異常，圓臉，發(fā)育遲緩，特發(fā)性肌張力異常，先天性心臟病等特征均與報道相符，判定患兒符合inv dup del（8p）綜合癥的臨床特征。利用染色體核型分析技術(shù)明確患兒8p臂內(nèi)倒位，結(jié)合CNV技術(shù)對8p倒位重復(fù)及缺失片段進(jìn)行精確定位，采用qPCR 技術(shù)選取斷裂區(qū)域交界處基因位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，綜合多種檢測技術(shù)及患兒臨床表現(xiàn)明確診斷為inv dup（8p）綜合征。

目前inv dup（8p）綜合征尚無有效治療方法，產(chǎn)前診斷可減少此類患兒的出生。雖然本例患兒的父母染色體核型分析結(jié)果均無異常，但再次妊娠時仍有再發(fā)風(fēng)險，建議通過產(chǎn)前診斷監(jiān)測8p的異常重組，利用羊水細(xì)胞染色體核型分析、熒光定量PCR分析及CNV等多種細(xì)胞及分子遺傳學(xué)檢測手段，結(jié)合B超監(jiān)測胎兒發(fā)育動態(tài)，對比臨床表型明確胎兒狀態(tài)。

今后對inv dup（8p）綜合征的研究重點(diǎn)應(yīng)為8p缺失、重復(fù)區(qū)域內(nèi)相關(guān)基因的劑量效應(yīng)與表型的相互關(guān)聯(lián)及對相應(yīng)基因功能的驗(yàn)證。