Glypican-1在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系*

賈國(guó)萍，李鑫，宋雨茜，宋濤，王珊

（1.中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 制藥工程系，湖南 長(zhǎng)沙 410038；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)外科，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的50%以上，具有起病隱匿、惡性程度高等特點(diǎn)[1]。目前治療方式以手術(shù)切除聯(lián)合放化療為主。由于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈彌漫性浸潤(rùn)且中樞神經(jīng)系統(tǒng)比較脆弱，所以患者預(yù)后較差，術(shù)后易復(fù)發(fā)，生存期短[2]。全球每年約有18.9 萬(wàn)新發(fā)病例，其中14.2 萬(wàn)例死亡，嚴(yán)重影響了人類健康[3-5]。因此，急需尋找腦膠質(zhì)瘤早期診斷及預(yù)后評(píng)估的有效分子靶標(biāo)，為腦膠質(zhì)瘤的診斷及治療提供理論依據(jù)。

Glypican-1 在人腦膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，具有促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的能力[6]。一項(xiàng)包含53 例腦膠質(zhì)瘤患者的臨床研究結(jié)果表明，腦膠質(zhì)瘤組織中Glypican-1 的表達(dá)與患者總生存期相關(guān)[7]，提示Glypican-1 可能是腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。然而，另一項(xiàng)包含31 例腦膠質(zhì)瘤患者的臨床研究結(jié)果表明，Glypican-1 的表達(dá)與臨床病理特征（包括總生存期和腫瘤分級(jí)）無(wú)關(guān)[8]。因此，只關(guān)注Glypican-1在腦膠質(zhì)瘤組織的總體表達(dá)水平可能不足以準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。除了蛋白的總體表達(dá)水平，蛋白的分布規(guī)律對(duì)評(píng)估疾病的預(yù)后亦有一定的指導(dǎo)意義。鑒于Glypican-1 可以在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，本研究收集171 例腦膠質(zhì)瘤患者的組織芯片，檢測(cè)Glypican-1 在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中的表達(dá)，并探討其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑

人腦膠質(zhì)瘤組織芯片購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司，共171 例腦膠質(zhì)瘤組織。其中，男性108 例，女性63 例；年齡2～80 歲。所有標(biāo)本按世界衛(wèi)生組織（WHO）（2007）神經(jīng)上皮腫瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行分級(jí)：Ⅰ級(jí)20 例，Ⅱ級(jí)79 例，Ⅲ級(jí)51 例，Ⅳ級(jí)21 例。

Glypican-1 兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司（貨號(hào)：16700-1-AP），免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB 顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司，蘇木精購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。

1.2 方法

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Glypican-1 的表達(dá)。腦膠質(zhì)瘤組織芯片經(jīng)二甲苯、梯度乙醇依次浸泡、脫蠟。在檸檬酸鹽抗原修復(fù)液中高壓修復(fù)，經(jīng)PBS 緩沖液清洗后，加入1 ∶50 稀釋的兔抗Glypican-1 抗體4℃孵育過(guò)夜。玻片室溫下復(fù)溫＞30 min，經(jīng)PBS 緩沖液沖洗后滴加二抗，室溫孵育30 min。使用DAB試劑盒顯色，沖洗后蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，自來(lái)水沖洗，室溫晾干后用中性樹膠封片。

結(jié)果的判讀采用雙盲法。聘請(qǐng)2 位病理學(xué)專家對(duì)組織芯片的免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。①根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無(wú)著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；②根據(jù)細(xì)胞染色陽(yáng)性率進(jìn)行評(píng)分：0%為0 分，＞0%～25%為1 分，＞25%～50% 為2 分，＞50%～75% 為3 分，＞75%～100%為4 分；最終總評(píng)分為染色強(qiáng)度評(píng)分與染色陽(yáng)性率評(píng)分的乘積[10]?？傇u(píng)分≤3 分為Glypican-1低表達(dá)，總評(píng)分＞3 分為Glypican-1 高表達(dá)。

1.3 隨訪

隨訪期限為手術(shù)時(shí)間（2008年2月—2011年10月）至2017年7月，每3 個(gè)月電話隨訪1 次，隨訪時(shí)間為6.0～9.4年，以患者死亡為終點(diǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)；影響因素的分析采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Glypican-1 在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Glypican-1 在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜中均有表達(dá)，且Glypican-1 在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜的黃染程度及范圍隨患者腫瘤分級(jí)升高而加深或擴(kuò)大。見(jiàn)圖1。

2.2 不同臨床病理特征患者腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞Glypican-1 的表達(dá)

圖1 Glypican-1 在不同腫瘤分級(jí)患者腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá) （免疫組織化學(xué)染色）

不同年齡患者腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞質(zhì)Glypican-1 高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），＞50 歲患者較高；不同性別、腫瘤分級(jí)患者腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞質(zhì)Glypican-1 高表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

不同腫瘤分級(jí)患者腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜Glypican-1高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ級(jí)患者較高；不同性別、年齡患者腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜Glypican-1 高表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同臨床病理特征患者腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜Glypican-1 高表達(dá)率比較 例（%）

2.3 Glypican-1 與腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系

不同性別患者的總生存期比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同年齡、腫瘤分級(jí)患者的總生存期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），＞50 歲和Ⅲ、Ⅳ級(jí)患者總生存期較短。不同腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞質(zhì)Glypican-1 表達(dá)水平患者的總生存期比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜Glypican-1 表達(dá)水平患者的總生存期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜Glypican-1 表達(dá)水平越高，患者總生存期越短。見(jiàn)表2和圖2。

以是否死亡為因變量，以其他參數(shù)為自變量，其中女性、年齡＞50 歲、腫瘤分級(jí)Ⅲ和Ⅳ級(jí)、腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞質(zhì)Glypican-1 高表達(dá)、腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜Glypican-1 高表達(dá)賦值為1。逐步多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，年齡＞50 歲、腫瘤分級(jí)Ⅲ和Ⅳ級(jí)、Glypican-1 在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜中高表達(dá)是患者預(yù)后的影響因素（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表2 影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的單因素分析

圖2 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜不同Glypican-1 表達(dá)水平患者的生存曲線

表3 影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的多因素分析參數(shù)

3 討論

GPCs 是HSPG 家族的一員，通過(guò)GPI 錨定附著于細(xì)胞膜表面[11]。GPCs 家族包括6 位成員（Glypican-1～Glypican-6）[12]。其 中Glypican-1 定 位 于 染 色體2q36，鄰 近COL4A3/4[13]。Glypican-1 在 胰 腺 癌、乳腺癌及食管鱗狀細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)[14-17]，其表達(dá)水平與多種癌癥的預(yù)后相關(guān)[15-17]，且Glypican-1 能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及血管生成[15-19]，綜上所述，Glypican-1 可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

研究表明，Glypican-1 在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251及腦膠質(zhì)瘤組織中呈高表達(dá)[8]。SAITO 等[7]發(fā)現(xiàn)經(jīng)放療及替莫唑胺治療后，腦膠質(zhì)瘤患者Glypican-1 表達(dá)水平與總生存期有相關(guān)性，但該研究未對(duì)Glypican-1表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤腫瘤分級(jí)的相關(guān)性進(jìn)行探討。筆者首次研究了Glypican-1 在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)，并分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜Glypican-1 表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)有關(guān)，且細(xì)胞膜Glypican-1 表達(dá)水平越高，患者預(yù)后越差，提示檢測(cè)Glypican-1 在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜中的表達(dá)水平可能比檢測(cè)Glypican-1 在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的總體表達(dá)水平更具有臨床意義。此外，本研究選取組織芯片進(jìn)行研究，在同等條件下檢測(cè)Glypican-1的表達(dá)及分布，降低了實(shí)驗(yàn)誤差；且該組織芯片包括171 例腦膠質(zhì)瘤患者的標(biāo)本，并對(duì)上述患者進(jìn)行6.0～9.4年的隨訪。因此，本研究具有樣本量大、隨訪時(shí)間長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)誤差小的優(yōu)勢(shì)，所得結(jié)論具有一定的說(shuō)服力，將為腦膠質(zhì)瘤的臨床診斷及預(yù)后判斷提供理論依據(jù)。