血管性認知障礙大鼠模型海馬損傷的MRI表征

黃明明，魏 琳，曹笑婉，伏 曉，曾邦峰，楊麗銘，余 暉，劉 靜

（貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院放射科，貴州 貴陽 550008）

血管性認知障礙（vascular cognitive impairment，VCI）是老年人群認知功能障礙最常見的2 種類型疾病之一。腦血管病變是老年人及神經(jīng)退行性病患者常見的隱匿性疾病，被認為是引起認知功能障礙及癡呆的主要危險因素［1-2］。海馬是公認的與認知功能密切相關的腦區(qū)，臨床研究［3-4］顯示，VCI 伴海馬萎縮。但目前對VCI 的早期診斷、有效治療和預后評估一直是醫(yī)學界面臨的難題。動物模型的MRI 研究作為連接疾病臨床和基礎研究的橋梁，可幫助理解VCI 進程中影像學指標與病理變化之間的聯(lián)系，將有助于更好地認識VCI 的發(fā)生及發(fā)展。因此，探討VCI 早期海馬的影像學表現(xiàn)及VCI 引起海馬的病理改變具有重要的臨床意義。本研究通過建立VCI 的大鼠模型，利用MRI 并結合組織化學染色發(fā)現(xiàn)VCI 引起海馬損傷的MRI 表征及其病理改變，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 VCI 大鼠模型制作 將30 只體質量約200 g的雄性SPF 級大鼠［購買于貴州醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證編號：SYXK（黔）2018-0001］隨機分為模型組20 只和對照組10 只，采用改良的Pulsinelli四血管閉塞（4-VO）法模擬全腦慢性缺血。大鼠術前12 h 禁食，4 h 禁水，使用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉（劑量300 mg/kg 體質量）。手術第1 天頸后正中切口，分離出C1兩側翼孔，用電凝針凝閉雙側椎動脈，縫合；24 h 后于大鼠頸部正中切開，鈍性分離雙側頸總動脈，并用血管夾夾閉10 min，共3 次，每次間隔1 h。大鼠發(fā)生缺血性改變判斷標準：夾閉雙側頸內(nèi)動脈后，皮膚黏膜變?yōu)榘咨?，眼球變白，自主活動消失，生命體征存在；放開動脈夾行再灌注時，皮膚黏膜及眼球逐漸變?yōu)榧t色，大鼠可自主活動。對照組重復以上過程，但不行血管處理。

1.2 儀器與方法

1.2.1 MRI 掃描 所有大鼠于造模后2 周、1 個月、3個月、5 個月行MRI 掃描，使用3.0 T 人體掃描儀及小動物專用4 通道相控陣表面線圈。使用10%水合氯醛對大鼠進行腹腔注射麻醉（劑量300 mg/kg 體質量），并將其頭部固定于表面線圈。

T2WI 解剖結構像，掃描參數(shù)：TR 5 800 ms，TE 80 ms，視野3.5 cm×3.5 cm，采集矩陣256×128，層厚1 mm，層數(shù)20。

1H-MRS 掃描采用單體素PRESS 序列，掃描參數(shù)：TR 2 000 ms，TE 40 ms，采集矩陣128×128，視野5 mm×8 mm×8 mm，翻轉角90°，激勵次數(shù)1，掃描時長4 min 52 s。根據(jù)大鼠MRI 軸位、冠狀位、矢狀位T2WI 確定ROI，即雙側海馬，盡量避開周圍腦脊液等結構。ROI 包含部分皮層及皮層下區(qū)域。

1.2.2 學習記憶能力檢測 用Morris 水迷宮檢測大鼠學習記憶功能變化，適應性喂養(yǎng)2 周行預掃描。選擇T2WI 結構像上大腦實質無明顯結構及信號異常的大鼠進行水迷宮實驗，主要包括定位航行和空間探索實驗兩部分。第1～5 天完成定位航行實驗，方法：每日將大鼠按1、2、3、4 象限順序面向池壁從入水點放入水池中，并記錄60 s 內(nèi)大鼠找到固定于第4 象限隱藏平臺的時間（即逃避潛伏期）及游泳路徑。每只大鼠每天訓練4 次，以其4 次逃避潛伏期的平均值作為當日的學習成績；第6 天完成空間探索實驗：撤去位于第4 象限的平臺，將大鼠按同樣方法放入水中，記錄其60 s 內(nèi)穿過第4 象限原平臺位置的次數(shù)及第1 次穿過原平臺位置的時間。

1.3 數(shù)據(jù)處理 在T2WI 圖像上手動畫出代表海馬面積的ROI（圖1），讀出像素個數(shù)。所有波譜原始數(shù)據(jù)導入電腦工作站，應用LCModel 軟件進行處理，主要包括N-乙酰天門冬氨酸（NAA）、肌酸（Cr）、肌醇（MI）、谷氨酸（Glu）的濃度。本研究采用NAA/Cr、MI/Cr、Glu/Cr 比值的方法代表各代謝物的含量變化，以消除個體差異。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。水迷宮數(shù)據(jù)處理：實驗數(shù)據(jù)以表示，模型組與對照組之間比較采用獨立樣本t 檢驗，模型組不同時間點的比較采用重復測量的方差分析，使用Origin 7.0 作圖，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析行兩樣本t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 水迷宮實驗結果 模型組大鼠術后2 周，即出現(xiàn)學習和記憶能力下降，與對照組大鼠相比，其逃避潛伏期及第1 次穿越平臺時間延長，穿越平臺次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。術后1、3、5 個月，其學習記憶能力持續(xù)下降（表1）。

2.2 海馬形態(tài)的變化 模型組大鼠2 周、1 個月海馬面積大小與對照組大鼠相比，差異均無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）；但在術后3、5 個月，模型組大鼠海馬體積明顯萎縮，與對照組大鼠相比，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖2）。

2.3 海馬區(qū)域代謝產(chǎn)物的異常 對海馬區(qū)域1H-MRS的定量分析，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠海馬內(nèi)存在代謝異常，與對照組比較，術后2 周其NAA/Cr 顯著下降、MI/Cr顯著升高，一直持續(xù)至術后5 個月；此外，Glu/Cr 在術后2 周出現(xiàn)顯著下降，術后1 個月下降至最低，而后略有回升（圖3）。

2.4 海馬區(qū)域HE 及Nissl 染色 海馬CA1 區(qū)錐體細胞排列紊亂、結構模糊，少數(shù)神經(jīng)元呈點狀或片狀嗜伊紅染色增強，似紅色神經(jīng)元。海馬錐體細胞胞漿內(nèi)尼氏體減少、染色減弱，部分錐體細胞胞漿內(nèi)尼氏體溶解、輪廓模糊著色淺淡（圖4）。

表1 Morris 水迷宮檢測大鼠學習記憶功能變化（）

表1 Morris 水迷宮檢測大鼠學習記憶功能變化（）

注：VCI，血管性認知障礙；* 與對照組比較，P＜0.05；# 與VCI 組（2 周）比較，P＜0.05；△與VCI 組（1 個月）比較，P＜0.05；○與VCI 組（3 個月）比較，P＜0.05。

圖1 左側紅色曲線勾畫出選取海馬的解剖位置圖2 柱狀圖顯示，從術后3 個月起，海馬出現(xiàn)萎縮［紅色為對照組，綠色為血管性認知障礙（VCI）模型組］圖3 ROI 區(qū)（主要為海馬大部分）1H-MRS 定量分析統(tǒng)計圖 圖3a 定位像紅色方框顯示的是 1H-MRS 波譜所采集的區(qū)域 圖3b～3d 柱狀圖分別顯示的是隨VCI 病程發(fā)展，NAA/Cr、Glu/Cr 及MI/Cr（NAA，N-乙酰天門冬氨酸；Cr，肌酸；MI，肌醇）比值的變化圖4 術后5 個月VCI 大鼠海馬HE 及Nissl 染色圖 圖4a（HE×100），4b（HE×200） 海馬CA1 區(qū)錐體細胞排列紊亂、結構模糊，少數(shù)神經(jīng)元呈點狀或片狀嗜伊紅染色增強 圖4c（Nissl×100），4d（Nissl×200） 顯示海馬錐體細胞胞漿內(nèi)尼氏體減少、染色減弱，部分錐體細胞胞漿內(nèi)尼氏體溶解、輪廓模糊著色淺淡

3 討論

本實驗采用改良Pulsinelli 4-VO 法制作VCI 大鼠模型，水迷宮實驗結果提示，與對照組相比，VCI組在造模后2 周即出現(xiàn)學習和記憶能力下降，表現(xiàn)為逃避潛伏期及第1 次穿越平臺時間延長，穿越平臺次數(shù)減少，證明VCI 模型制作成功。VCI 模型大鼠的學習和記憶能力隨術后時間的延長，損害加重，說明此模型引起的全腦慢性缺血性改變可持續(xù)造成海馬的損傷。

海馬是公認的與認知功能密切相關的腦區(qū)，臨床實驗［3-4］顯示，VCI 伴海馬萎縮，且兩側海馬體積明顯不對稱，左側海馬體積萎縮更明顯。動物實驗［5］也發(fā)現(xiàn)，VCI 動物模型存在明顯的海馬損傷，海馬損傷可導致認知能力的受損，且認知能力下降程度與海馬組織受損的體積大小相關。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠2 周、1 個月海馬體積大小與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（均P>0.05），但在術后3、5 個月，VCI 模型組大鼠海馬體積明顯萎縮，與對照組大鼠相比，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），提示海馬組織損傷明顯；且隨時間延長，損傷加重，認知能力下降越明顯。

1H-MRS 是目前檢測腦內(nèi)代謝物和生化成分的唯一非侵襲性技術，具有很好的可重復性及穩(wěn)定性，它可提供神經(jīng)元的功能、活力、完整性、能量代謝及神經(jīng)膠質增生等信息［6］。據(jù)報道［7］，VCI 患者NAA、NAA/Cr 水平降低，卒中后無認知障礙的患者無神經(jīng)代謝的改變，但伴認知功能障礙者頂、枕葉NAA 水平顯著降低［8］。MI 僅存在于膠質細胞中，其功能和維持神經(jīng)膠質細胞的體積穩(wěn)定有關，升高則提示膠質增生［9］。既往研究［7］顯示，雙側海馬MI 的升高與認知損害程度呈正相關，說明認知損害隨海馬區(qū)神經(jīng)膠質細胞增生的程度加深而不斷加重。在阿爾茨海默病研究［10-11］中發(fā)現(xiàn)，輕度認知障礙患者海馬MI/Cr 值顯著增加，且其敏感程度高于NAA 的降低。本研究也發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，VCI 模型組大鼠MI/Cr 升高，術后1、3、5 個月大鼠海馬MI/Cr 較術后2 周升高，表明VCI 模型組大鼠海馬早期即出現(xiàn)神經(jīng)膠質細胞的增生。

綜上所述，VCI 大鼠在術后2 周即出現(xiàn)海馬代謝物的異常，主要為NAA 含量的持續(xù)降低及MI 含量的持續(xù)上升，而在術后3 個月，海馬才表現(xiàn)出明顯萎縮。因此，推測VCI 大鼠海馬內(nèi)代謝物的改變可能早于海馬形態(tài)的改變，VCI 大鼠海馬NAA 濃度的早期降低和MI 濃度的早期升高可能成為VCI 早期診斷的觀察指標。