海帶愈傷組織高效誘導(dǎo)體系的研究

劉延嶺，李言，姜黎明，田萍萍，彭捷，李曉捷

（山東東方海洋科技股份有限公司，國(guó)家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264003）

海帶自然分布在高緯度海區(qū)，如日本、朝鮮半島、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)沿海[1]，是一種冷溫性的大型經(jīng)濟(jì)褐藻。多附生在海底巖礁上，是人工栽培生產(chǎn)最多的海藻之一，產(chǎn)量及栽培面積在我國(guó)所有藻類(lèi)中均為第一[2]。根據(jù)細(xì)胞核、葉綠體和線(xiàn)粒體序列的多基因分析結(jié)果，其分類(lèi)系統(tǒng)隸屬于褐藻門(mén)（Phaeophyta），褐子綱（Phaeosporeae），海帶目（Laminariales），海帶科（Laminariaceae），Saccharina 屬[3]。海帶具有典型的世代交替生活史，大型孢子體世代為二倍體世代，是人工栽培和加工生產(chǎn)的主要對(duì)象；配子體世代為單倍體世代，是人工培育苗種的對(duì)象。海帶孢子體由葉片、柄和固著器三個(gè)部分組成。藻體的葉片基部和柄連接地方是生長(zhǎng)部，生長(zhǎng)部的細(xì)胞分裂機(jī)能最強(qiáng)。

海藻組織培養(yǎng)從20世紀(jì)60年代開(kāi)始研究，70年代有了海藻組織培養(yǎng)成功的報(bào)道[4-5]，80年代以后進(jìn)展較迅速[6]。海帶的愈傷組織給予合適條件，能夠重新分化并發(fā)育成正常孢子體；同時(shí)可以長(zhǎng)期保存，通過(guò)懸浮培養(yǎng)而迅速增殖，進(jìn)行無(wú)性繁殖育苗。1978年Saga[7]開(kāi)始研究海帶愈傷組織培養(yǎng)，從獲得的愈傷組織中分離單個(gè)細(xì)胞并成功誘導(dǎo)分化形成孢子體，證明了褐藻愈傷組織與高等植物的愈傷組織一樣具有全能性[8]。方宗熙等[9]通過(guò)對(duì)海帶與裙帶菜不同組織比較，發(fā)現(xiàn)葉片生長(zhǎng)部和中帶部誘導(dǎo)愈傷組織和再分化率最高，柄部次之，假根部最低，柄和假根愈傷組織很難再分化成孢子體。

海藻組織培養(yǎng)在紫菜中發(fā)展較成熟[10-11]，而在以海帶為代表的我國(guó)主要大型經(jīng)濟(jì)褐藻中的研究還不夠深入，該研究通過(guò)對(duì)海帶愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中不同消毒劑及其時(shí)間組合、不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基及生長(zhǎng)素組合、不同接種外植體部位誘導(dǎo)差異等因素的比較研究，建立了一套海帶愈傷組織高效誘導(dǎo)體系，以期為海帶細(xì)胞工程育種研究提供一種有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

5月，從海區(qū)隨機(jī)選取生長(zhǎng)狀況良好的新鮮海帶，在實(shí)驗(yàn)室中用剪刀在生長(zhǎng)部剪取大小合適的海帶塊，用無(wú)菌脫脂棉和無(wú)菌海水擦拭15～20 min至表面干凈無(wú)粘液，放到滅菌培養(yǎng)皿中備用。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

利用煮沸海水分別配置：MS液體培養(yǎng)基[12]；PESI液體培養(yǎng)基[13]；ESS液體培養(yǎng)基[14]，高壓滅菌備用。

利用煮沸海水分別配置：1.5%質(zhì)量濃度的KI；4%體積濃度NaClO；10%體積濃度H2O2；含有60 mg/L青霉素及100 mg/L環(huán)丙沙星的雙抗溶液，用一次性針頭濾器抽濾除菌備用。

先用1 mol/L的NaOH溶液溶解，再用滅菌一蒸水分別配置：2.0 mg/L的NAA；0.1 mg/L的KT，用一次性針頭濾器抽濾除菌備用。

1.3 外植體的消毒

分別使用 1.5%KI、雙抗、4%NaClO、10%H2O2四種消毒劑，消毒時(shí)間分別為5 min，10 min以及1.5%KI、雙抗消毒劑組合進(jìn)行外植體消毒處理。消毒結(jié)束的海帶組織，用無(wú)菌海水浸泡2次，每次5 min，得到的無(wú)菌海帶組織放到干凈的培養(yǎng)皿中備用。

1.4 不同外植體的選擇

用無(wú)菌手術(shù)刀將無(wú)菌海帶組織塊的邊緣切掉，將剩余的組織塊切割成5 mm×5 mm大小的塊，將一半的組織塊放到干凈的培養(yǎng)皿中備用，將另一半的組織塊兩面的表皮切割掉，表皮盡量薄，少帶葉肉，將表皮和葉肉單獨(dú)存放到無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，然后整塊組織、表皮組織、葉肉組織分別接種到PESI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件15℃，10 h光照/14 h黑暗，培養(yǎng)觀(guān)察結(jié)果。

1.5 不同培養(yǎng)基的選擇

用無(wú)菌手術(shù)刀將無(wú)菌海帶組織塊的邊緣切掉，將剩余的組織塊切割成5 mm×5 mm大小的塊，接種到MS、PESI、ESS的培養(yǎng)基上，每周更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件15℃，10 h光照/14 h黑暗，定期觀(guān)察生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.6 不同激素組合

用海帶表皮組織，表皮盡量薄，少帶葉肉，然后分別接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)；誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為不添加激素、添加NAA激素、添加KT激素，添加NAA+KT激素的PESI液體培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件15℃、10 h光照/14 h黑暗，培養(yǎng)觀(guān)察結(jié)果。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

愈傷組織的誘導(dǎo)率、污染率按下列公式計(jì)算：

誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)數(shù)/未污染數(shù)×100%；

污染率=（接種數(shù)-未污染數(shù)）/接種數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 不同消毒方式的除菌效果

選用了10種消毒方法對(duì)外植體進(jìn)行除菌處理，培養(yǎng)基30 d觀(guān)察統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1；由數(shù)據(jù)可知，1.5%KI+雙抗各處理10 min的效果最佳，污染率僅為10%；其次是4%NaClO處理10 min，污染率為13%；第三位是10%H2O2處理10 min，污染率為20%；4%NaClO和10% H2O2對(duì)接種材料的傷害較大，組織培養(yǎng)一周觀(guān)察有腐爛現(xiàn)象，不利于后續(xù)的愈傷誘導(dǎo)。

表1 不同消毒方式的除菌效果統(tǒng)計(jì)

2.2 不同接種外植體部位對(duì)海帶愈傷組織誘導(dǎo)的影響

選擇了3個(gè)外植體部位進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，分別為整塊組織、表皮組織、葉肉組織，經(jīng)過(guò)60 d的誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)率結(jié)果見(jiàn)表2；由表中數(shù)據(jù)可以看出：表皮組織的愈傷誘導(dǎo)率最高，誘導(dǎo)率為88%；其次為整塊組織，誘導(dǎo)率為68%；葉肉組織低，誘導(dǎo)率為50%；整塊海帶組織和表皮組織誘導(dǎo)出了褐色愈傷組織，見(jiàn)圖1。

表2 不同接種外殖體對(duì)海帶愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)海帶愈傷組織誘導(dǎo)的影響

選擇了MS、PESI、ESS三種液體培養(yǎng)基進(jìn)行海帶愈傷組織誘導(dǎo)，經(jīng)過(guò)60 d的培養(yǎng)，誘導(dǎo)情況見(jiàn)表3。由誘導(dǎo)率看出：PESI液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率為85%；其次為ESS培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為65%；MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)率最低，僅為20%。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)海帶愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4 不同激素種類(lèi)對(duì)海帶愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以表皮組織為接種外植體，誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為不添加激素、添加NAA激素、添加KT激素，添加NAA+KT激素的PESI液體培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，結(jié)果見(jiàn)表4。由結(jié)果看出：添加NAA的PESI液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)率為85%；添加NAA+KT激素的PESI液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)率為83%；添加KT激素和不添加激素的PESI液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)率均為80%；KT激素對(duì)海帶愈傷組織沒(méi)有明顯誘導(dǎo)作用，NAA激素和KT激素這兩種激素在海帶愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中所起的協(xié)同作用不明顯。

表4 不同激素種類(lèi)對(duì)海帶愈傷組織誘導(dǎo)的影響

3 討論

海藻組織的無(wú)菌處理方式一直不成熟，一方面是由于藻體表面附有大量微生物，其藻體內(nèi)部也存在一些共生菌，很難做到無(wú)菌[15]；另一方面藻體纖弱，高等植物的無(wú)菌處理方法不適用。王素娟等[16]在對(duì)海藻組織進(jìn)行消毒試驗(yàn)時(shí)也指出，可根據(jù)試驗(yàn)需求選擇不同的消毒試劑。KI和NaClO處理后的海帶染菌率為58.7%，但NaClO氧化性很強(qiáng)，組織塊損傷嚴(yán)重，與該文試驗(yàn)結(jié)果基本一致，一般不采用NaClO消毒藻體。該試驗(yàn)選用了KI和雙抗組合，能達(dá)到較好的消毒處理效果。

該試驗(yàn)分別選用了MS、PESI、ESS三種液體培養(yǎng)基對(duì)海帶組織進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)試驗(yàn)。由試驗(yàn)結(jié)果可知，PESI液體培養(yǎng)基對(duì)海帶愈傷組織的誘導(dǎo)率最高。1992年Notoya[17]研究了用海水PESI培養(yǎng)基加入干酪素來(lái)誘導(dǎo)海帶愈傷組織的機(jī)制。王希華等[18]發(fā)現(xiàn)PESI固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)海帶愈傷組織效果較好，誘導(dǎo)率可達(dá)75.5%。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加NAA激素的PESI液體培養(yǎng)基更有助力于海帶愈傷組織的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率高達(dá)85%。

該試驗(yàn)選擇接種的外植體部位是消毒處理后的海帶表皮組織、葉肉組織和整塊海帶組織，分別培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)組織培養(yǎng)初期均出現(xiàn)透明愈傷組織，培養(yǎng)一段時(shí)間后，海帶表皮組織的透明愈傷組織逐漸長(zhǎng)出褐色愈傷組織；整塊海帶組織也逐漸長(zhǎng)出褐色愈傷組織；而葉肉組織只培養(yǎng)出透明的絲狀愈傷組織。觀(guān)察發(fā)現(xiàn)透明愈傷組織可能是由海帶的葉肉細(xì)胞產(chǎn)生的，而褐色愈傷組織可能是由海帶的表皮細(xì)胞產(chǎn)生的。Yan等[19]曾報(bào)道海帶的分化程度低，易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，并在皮層和髓部形成愈傷組織。

關(guān)于激素對(duì)海帶愈傷組織誘導(dǎo)的影響，Saga等[7]指出 IAA、NAA、2’4-D 等激素對(duì)網(wǎng)管藻愈傷組織的誘導(dǎo)沒(méi)有作用；Yan指出C-751植物合成激素有促進(jìn)海藻愈傷組織誘導(dǎo)的作用；該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NAA激素對(duì)海帶愈傷組織的形成有一定的促進(jìn)作用。

該試驗(yàn)結(jié)果表明，以海帶生長(zhǎng)部的表皮組織作為誘導(dǎo)材料，KI和雙抗組合進(jìn)行消毒，并利用添加激素NAA的PESI液體培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，取得的誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率高達(dá)85%。此誘導(dǎo)體系高效、易操作、結(jié)果穩(wěn)定。該誘導(dǎo)體系的建立為后續(xù)進(jìn)行海帶分化育苗等方面的研究提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)；如果能夠利用海帶組織誘導(dǎo)培養(yǎng)出的愈傷組織進(jìn)一步培養(yǎng)分化成苗技術(shù)而直接進(jìn)行海帶的苗種培育，將大大縮短海帶育苗期，降低生產(chǎn)成本，這將為海帶育種提供一種新的途徑，具有較高的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。