miR-499 與miR-1 對心肌細胞增殖與凋亡調(diào)控作用及機制研究

李倩曉 于勤 那榮妹 劉百亭

1.浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江 杭州310000；2.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧 大連116001

心肌細胞凋亡是心律失常、心肌梗死、心力衰竭等多種心臟疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的重要病理環(huán)節(jié)之一［1]。對心肌細胞凋亡進行積極干預(yù)已成為治療心臟疾病的關(guān)鍵研究方向。微小RNA（microRNA，miRNA）在細胞增殖、分化及凋亡中發(fā)揮重要作用，參與心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等病理生理過程［2]。研究顯示，miRNA 可調(diào)控30%以上人類基因表達［3]。miR-499、miR-1 是與心臟疾病關(guān)系密切的兩種miRNA，近年來已得到廣泛研究，尤其在調(diào)控心肌細胞增殖與凋亡方面越來越受到關(guān)注，但其具體調(diào)控機制目前尚不明確。因此，本研究將miR-499mimics 及miR-1inhibitor轉(zhuǎn)染至H2O2處理的心肌細胞，探索心肌細胞增殖與凋亡過程中，miR-499 與miR-1 所發(fā)揮的調(diào)控作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 大鼠H9C2 心肌細胞株（中科院上海細胞庫）。

1.2 實驗試劑與儀器 0.05%胰酶/EDTA、胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基（Hycloneo 公司，美國）；競爭性短核糖核苷酸陰性對照序列（scramble-NC）、miR-1 inhibitor、miR-1、miR-499、U6 引物序列（上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，中國）；miR-499 mimics（廣州銳博公司，中國）；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine2000（Invitrogen公司，美國）；H2O2、膜聯(lián)蛋白（An-nexin）V-異硫/碘化丙錠（PI）細胞凋亡試劑盒、CCK8 試劑盒（碧云天試劑公司，中國）；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（Thermo 公司，美國）；β-actin、Bcl-xl、Bax 單抗購自（Epitmics 公司，美國）；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（millipore 公司，美國）；RNasee Free ddH2O、miRNeasy Serum/plasma Kit、miScript SYBR Green PCR Kit、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（QIAGEN 公司，德國）；7500 Fast real time PCR 儀（ABI 公司，美國）；酶標儀（Bio Tek 公司，美國）。

1.3 細胞培養(yǎng) 將H9C2 心肌細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3d 進行1 次細胞傳代。實驗前24h 取對數(shù)生長期的細胞備用。

1.4 轉(zhuǎn)染 將細胞分為陰性對照組、miR-499 mimics組、miR-1 inhibitor 組、空白對照組。陰性對照組、miR-499 mimics 組及miR-1 inhibitor 組分別采用隨機合成的miRNA 片段、miR-499 mimics 及miR-1 inhibitor 片段通過LipofectamineTM2000 進行轉(zhuǎn)染（濃度200nm），處理時間6h。空白對照組不予任何處理。隨后將細胞繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h 后收集細胞。

1.5 轉(zhuǎn)染結(jié)果檢測 采用miRNeasy Serum/plasma Kit試劑盒提取血清RNA，檢測RNA 純度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA 逆轉(zhuǎn)錄為特定cDNA，-80℃下保存?zhèn)溆?。RT-PCR 反應(yīng)：以cDNA 作模版，配制陰性對照組、miR-499 mimics 組、miR-1 inhibitor 組、空白對照組反應(yīng)管，以U6 作內(nèi)參，依據(jù)試劑盒及儀器說明書嚴格進行操作。

1.6 實驗分組分為空白對照組、H2O2組（未轉(zhuǎn)染的H9C2 心肌細胞）、干預(yù)組A（miR-499 mimics 轉(zhuǎn)染的H9C2 心肌細胞）、干預(yù)組B（miR-1 inhibitor 轉(zhuǎn)染的H9C2 心肌細胞）、干預(yù)組C（miR-499 mimics+miR-1 inhibitor 轉(zhuǎn)染的H9C2 心肌細胞）。

1.7 H2O2處理 H2O2組、干預(yù)組A、干預(yù)組B 及干預(yù)組C 均采用200μmol/L 的H2O2處理6h，空白對照組不予任何處理。

1.8 細胞增殖及凋亡檢測 將細胞以1×104個/孔接種至96 孔板中，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h以上。細胞貼壁后，將H2O2處理的各組細胞加入96 孔板中，經(jīng)CCK8 試劑處理后，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，震蕩5min，于570nm 波長處測定OD 值。取H2O2處理后的各組細胞，PBS 洗滌3 次，消化、離心、收集細胞后，PBS 洗滌2 次，再次離心，收集細胞。隨后加入binding buffer（200μL），制成單細胞懸液后，分別加入Annexin V-FITC 和PI 試劑（濃度250μg/mL）各5μL，避光反應(yīng)10min 后，即予流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.9 Bcl-xl、Bax 蛋白表達水平檢測 將細胞加入裂解液處理30min，收集蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，蛋白樣品煮沸變性5min，上樣，每泳道40μg 蛋白樣品經(jīng)80g/L SDS-PAGE 電泳分離蛋白1～2h 后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2h，分別加入1∶1000 稀釋的βcatenin、Bcl-xl、Bax 特異性抗體。4℃孵育過夜后，PBST 液洗膜，加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，室溫孵育2h，ECL 顯色，Image J 軟件分析各條帶光密度。

1.10 觀察指標 ①RT-PCR 檢測miR-499 mimics 及miR-1 inhibitor 轉(zhuǎn)染效果；②各組H9C2 心肌細胞增殖檢測結(jié)果；③各組H9C2 心肌細胞凋亡檢測結(jié)果；④各組H9C2 心肌細胞Bcl-xl、Bax 蛋白表達檢測。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，P＜0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測miR-499 mimics 及miR-1 inhibitor轉(zhuǎn)染效果 與陰性對照組、空白對照組比較，miR-499 mimics 組H9C2 心肌細胞miR-499 表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與陰性對照組、空白對照組比較，miR-1 inhibitor 組H9C2 心肌細胞miR-1 表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。陰性對照組與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 心肌細胞增殖及凋亡檢測結(jié)果 H2O2組細胞增殖較空白對照組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)組A、干預(yù)組B、干預(yù)組C 細胞增殖較H2O2組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。H2O2組細胞凋亡率較空白對照組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)組A、干預(yù)組B、干預(yù)組C 細胞凋亡率較H2O2組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表1 RT-PCR 檢測miR-499 mimics 及miR-1 inhibitor轉(zhuǎn)染效果（±s）

表1 RT-PCR 檢測miR-499 mimics 及miR-1 inhibitor轉(zhuǎn)染效果（±s）

注：與陰性對照組、空白對照組比較，*P＜0.05；與空白對照組比較，▲P＞0.05

組別 miR-499 miR-1空白對照組 1.02±0.12 0.66±0.14陰性對照組 1.05±0.15▲ 0.71±0.16▲miR-499 mimics 組 1.97±0.25* -miR-1 inhibitor 組 - 0.23±0.08*

表2 心肌細胞增殖及凋亡檢測（±s）

表2 心肌細胞增殖及凋亡檢測（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與H2O2 組比較，#P＜0.05

組別 細胞增殖（OD 值） 細胞凋亡率（%）空白對照組 0.43±0.35 2.83±0.45 H2O2 組 0.17±0.18* 24.32±1.36*干預(yù)組A 0.30±0.24*# 7.62±1.43*#干預(yù)組B 0.26±0.21*# 10.43±1.94*#干預(yù)組C 0.38±0.26*# 4.58±0.75*#

2.3 Bcl-xl、Bax 蛋白表達水平 H2O2組Bcl-xl 蛋白表達水平較空白對照組降低，Bax 蛋白表達水平較空白對照組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)組A、干預(yù)組B、干預(yù)組C Bcl-xl 蛋白表達水平較H2O2組升高，Bax 蛋白表達水平較H2O2組降低，存差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 Bcl-xl、Bax 蛋白表達水平（±s）

表3 Bcl-xl、Bax 蛋白表達水平（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與H2O2 組比較，#P＜0.05

組別 Bcl-xl Bax空白對照組 0.973±0.138 0.267±0.051 H2O2 組 0.383±0.042* 0.713±0.045*干預(yù)組A 0.787±0.048# 0.553±0.035#干預(yù)組B 0.837±0.066# 0.573±0.035#干預(yù)組C 0.935±0.085# 0.323±0.026#

3 討論

在心臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中，miRNA 發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用［4，5]。miRNA 廣泛存在于真核生物中，由18～25 個核苷酸構(gòu)成，屬于非編碼型小分子RNA，在物種間高度保守，具有組織特異性、時序性，與心血管疾病關(guān)系密切，影響miRNA 表達可引起心律失常、心肌肥厚、心肌梗死等，是生命科學(xué)領(lǐng)域中目前重點及熱點研究方向［6-9]。

心肌受損的重要形式是心肌細胞凋亡，最終導(dǎo)致心臟收縮功能進行性下降［10]。在心肌細胞凋亡經(jīng)典通路中，以線粒體凋亡通路尤為重要。Bcl-2 家族蛋白是線粒體凋亡通路的主要調(diào)節(jié)蛋白，包括抗凋亡蛋白（如Bcl-xl，可抑制細胞凋亡）與促凋亡蛋白（如Bax，可促進細胞凋亡），共同調(diào)節(jié)細胞凋亡［11，12]。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-499 在心室中高度表達［13]。miR-499 在心肌細胞氧化應(yīng)激損傷過程中，具有抑制心肌細胞凋亡作用［14]。與無心力衰竭患者比較，缺血性心力衰竭患者miR-499 表達下調(diào)了3.5倍［15]。通過上調(diào)急性心肌梗死大鼠心肌組織miR-499 表達，其心肌細胞凋亡率顯著降低［16]。在本研究中，經(jīng)H2O2處理后，心肌細胞凋亡率顯著升高，而通過miR-499 mimics 轉(zhuǎn)染的心肌細胞凋亡得到明顯抑制，表明上調(diào)miR-499對心肌細胞具有保護作用。

miR-1 在調(diào)控心肌細胞分化以及心臟功能、心律失常方面具有重要作用，是心肌細胞中含量最高的miRNA［17-19]。過表達miR-1 可使心肌細胞凋亡率增加［20]。在心肌細胞中，miR-1 為響應(yīng)氧化應(yīng)激，表達量顯著提高，進而促進心肌細胞凋亡，增加心力衰竭發(fā)生概率［21]。研究發(fā)現(xiàn)，在高糖條件下，其表達量顯著提高，進而促進心肌細胞凋亡［22]。本研究將miR-1 inhibitor轉(zhuǎn)染至H9C2 心肌細胞，予H2O2處理，結(jié)果顯示，miR-1 inhibitor 干預(yù)后心肌細胞凋亡率較未轉(zhuǎn)染心肌細胞顯著降低，表明miR-1 對心肌細胞凋亡具有促進作用。

本研究表明上調(diào)miR-499 或抑制miR-1 均能有效提高心肌細胞增殖。當兩者同時進行干預(yù)后，心肌細胞增殖可進一步提高，而細胞凋亡率則進一步降低。通過檢測重要抗凋亡蛋白Bcl-xl、促凋亡蛋白Bax，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-499 mimics 和miR-1 inhibitor 心肌細胞，Bcl-xl 明顯升高，而Bax 明顯降低，當兩者同時進行干預(yù)，則其升高及降低幅度尤為顯著，表明miR-499 可能是通過上調(diào)Bcl-xl、下調(diào)Bax 蛋白發(fā)揮抑制細胞凋亡作用，而miR-1 則通過下調(diào)Bcl-xl、上調(diào)Bax 蛋白發(fā)揮促進細胞凋亡作用。但是，兩者對于Bcl-xl、Bax蛋白的調(diào)控是直接調(diào)控還是通過調(diào)控相關(guān)靶基因間接調(diào)控尚未清楚，其具體調(diào)控機制仍需大量實驗加以驗證。

綜上所述，在心肌細胞增殖與凋亡過程中，miR-499 與miR-1 發(fā)揮重要調(diào)控作用。miR-499 通過上調(diào)Bcl-xl、下調(diào)Bax 蛋白表達抑制心肌細胞凋亡，而miR-1 則通過下調(diào)Bcl-xl、上調(diào)Bax 蛋白表達促進心肌細胞凋亡。隨著相關(guān)研究的不斷深入，將有助于為心血管疾病的預(yù)防和治療探索出新的策略。