合歡皮正丁醇提取物的毒理學(xué)評價＊

侯 豹，李忠杰，孫姜楠，艾 敏，蔡維維，倪露露，邱麗穎

研究表明，焦慮的特征是具有持續(xù)的恐懼感，不僅阻礙人體機能的放松，還會加速衰老［1-3］。對焦慮的深入研究有助于臨床藥物的開發(fā)和身心健康的全面發(fā)展［4］。合歡皮作為一種民間藥物，對失眠、乏力、意識不清有良好的治療作用［5］。合歡皮水提物的化學(xué)成分包括皂甙、木脂素、酚苷、黃酮和生物堿［6］，其中主要成分為皂甙和木脂素［7］。 然而，合歡皮正丁醇提取物作為一種中藥混合物，當(dāng)前對其毒性反應(yīng)的研究尚不清楚。肝臟作為一個主要的代謝和解毒器官，參與許多重要的生理功能［8］。藥物和天然產(chǎn)物都可以通過各種機制引起肝損傷、腎損傷等［9］。筆者研究合歡皮正丁醇提取物的肝毒性和腎毒性，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑AST、ALT、AKP、TP、白蛋白、CRE、BUN和尿蛋白試劑盒均取自南京建誠生物科技有限公司，蘇木精和伊紅購自武漢博士得生物工程技術(shù)有限公司，合歡皮正丁醇提取物購自上海合武生物科技有限公司。沃特斯1525高效液相色譜儀，紫外可見檢測器（2489型）。

1.2動物該研究經(jīng)江南大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。所有小鼠均取自上海斯萊克實驗動物有限公司。所有小鼠均在隔離設(shè)施中，在恒定的溫度和濕度控制的環(huán)境中喂養(yǎng)，進行12 h晝夜光照循環(huán)。用15只8周齡、體重20～25 g的雌性小鼠（ICR）研究了ANE的體內(nèi)毒性。三組分別給予PBS、ANE （8 mg/kg）和ANE（40 mg/kg），每日 0.2 ml胃腸道給藥，連續(xù)給藥30 d，取尿、內(nèi)臟和血液進行分析。用15只6周齡、體重18～20 g的雌性小鼠（C57BL/6）研究ANE對腫瘤生長的影響。選擇的劑量是根據(jù)人類最高治療劑量（45 mg/70 kg·d，主要抑郁癥推薦的最大治療劑量）的1倍和5倍作為動物的給藥劑量。從人到動物的劑量轉(zhuǎn)換是根據(jù)體表面積換算公式進行［10］。使用了以下公式［11］：Animal dose（mg/kg）=［Human Dose（mg/kg）×Human Km］/Animal Km，其中，Km 是一個相關(guān)系數(shù)，通過將動物的平均體重（kg）除以其表面積（m2）計算得出：人類 Km=37，小鼠 Km=3。

1.3血液分析先從小鼠眼球采集血液進行分析。動物處死后，迅速取出心、肝、脾、肺、腎等組織進行病理學(xué)檢查。血液樣本孵育1 h，離心后取上清（2000 r/m，5 min）。采用ELISA試劑盒（南京建成生物科技有限公司）檢測血清。

1.4植物提取與鑒定采用75%EtOH提取合歡皮粉，然后將合歡皮粉過濾，減壓濃縮于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中。將提取液懸浮于水中，分別用乙醇酸乙酯和正丁醇對其進行分離，用高效液相色譜法對合歡提取液進行了表征，并在 C18 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）上對其進行組分分離。流動相采用0.1%甲酸-水（A-乙醇（B）梯度洗脫，紫外檢測波長254 nm。

1.5蘇木精伊紅染色法心臟、肝臟、脾臟、肺、腎和腫瘤用4%多聚甲醛緩沖液固定，按常規(guī)組織處理方法進行處理，處理后組織石蠟包埋。制備5 μm厚的皮膚組織切片，然后按標(biāo)準(zhǔn)方法用蘇木精和伊紅（H＆E）染色，并在光學(xué)顯微鏡（Nikon ECLIPSE 80i）下進行觀察。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)以（）表示。采用t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANE成分鑒定研究表明，該ANE的主要成分為皂甙和木脂素，其指紋圖譜如圖1所示。

2.2 ANE對肝臟的毒性反應(yīng)ANE對肝臟的毒性反應(yīng)。如圖2a所示為8 mg/kg和40 mg/kg組的肝臟指數(shù)，與對照組相比，40 mg/kg組血清中AST和白蛋白的活性水平顯著降低（圖2b和f）。8 mg/kg組和40 mg/kg組的ALT、AKP和TP（總蛋白）活性沒有顯著差異（圖2c～e）。由圖2g可見，H＆E染色結(jié)果顯示：40 mg/kg組血竇擴張，門靜脈周圍可見散在變性空泡細(xì)胞，8 mg/kg組小葉結(jié)構(gòu)正常。

2.3 ANE對腎臟的毒性反應(yīng)ANE對腎臟的毒性反應(yīng)。如圖3a所示，8 mg/kg、40 mg/kg組與對照組腎臟指數(shù)無差異。與對照組相比，40 mg/kg組血清BUN和尿蛋白活性水平顯著降低（圖3c和d）。如圖（3b和e）所示，CRE濃度和尿pH值變化不明顯（P＞0.05）。H＆E 染色結(jié)果顯示，8 mg/kg組腎皮質(zhì)正常，可見腎小體、近曲小管和遠曲小管。40 mg/kg組出現(xiàn)明顯的腎小球充血和間質(zhì)性出血（圖3f）。

2.4 ANE對其他器官的毒性反應(yīng)進一步探討ANE對其他主要器官系統(tǒng)的潛在毒性反應(yīng)。觀察心、脾、肺毒性反應(yīng)。8 mg/kg組和40 mg/kg組的心、脾和肺指數(shù)與對照組相比無顯著性差異（圖4a～c）。HE染色脾、心、肺等臟器的病理變化見（圖4d～f）。結(jié)果分析表明，8 mg/kg給藥組與對照組相比無明顯變化。結(jié)果表明，8 mg/kg劑量的ANE對小鼠脾、心、肺均無毒性反應(yīng)。同時評價了ANE對小鼠體重的影響。

圖1 ANE的HPLC圖譜

2.5 ANE對小鼠體重的影響給藥初期，小鼠體重略有下降。給藥中期，小鼠體重增加，給藥結(jié)束時，小鼠體重逐漸增加（圖5）。結(jié)果表明，灌胃給藥后小鼠體重逐漸增加。ANE對小鼠體重?zé)o明顯影響。

圖2 ANE對肝的毒性作用

圖3 ANE對腎臟的毒性作用

圖4 ANE對其他器官的毒性作用

圖5 ANE對小鼠體重的影響

3 討論

中藥合歡皮具有良好的抗焦慮作用，其有效成分主要集中在ANE中。已有報道ANE對癌癥患者具有抗焦慮作用，但是對ANE的毒性反應(yīng)還沒有深入的研究。

肝腎功能是評價藥物毒性反應(yīng)的重要指標(biāo)之一［12］。因為肝臟既是毒性的主要靶點，又是主要的代謝和解毒器官。藥物、外源性物質(zhì)、天然產(chǎn)物和工業(yè)毒物都可以通過多種機制造成肝損傷。血清中某些酶的活性，通常被稱為肝酶。這些酶包括天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（AKP）［13］。它們廣泛應(yīng)用于從篩選肝病到監(jiān)測藥物不良反應(yīng)，以及確定對特定肝病的治療反應(yīng)［14］。白蛋白主要在肝臟合成，但白蛋白mRNA也可在胰腺、腎臟和大腦中檢測到［15］。白蛋白是肝硬化最重要和最廣泛使用的預(yù)后指標(biāo)［16］。40 mg/kg組血清AST和白蛋白水平降低可能是肝功能不全所致（圖3b 和 f）。

與其他組織相比，腎臟可能暴露在更高濃度的毒物中。腎損傷可導(dǎo)致廣泛的系統(tǒng)性紊亂，由于再生能力有限，長期腎功能不全可能是由于接觸腎毒性物質(zhì)所致。最常用的腎功能評估指標(biāo)是血尿素氮（BUN）和血清肌酐（CRE）濃度。血尿素氮的變化是腎損害的重要指標(biāo)［17］。尿蛋白是心血管和腎臟損害的有力預(yù)測因子，準(zhǔn)確評估尿蛋白對評估和管理慢性腎臟疾病至關(guān)重要［18］。40 mg/kg組BUN和尿蛋白活性降低可能是由腎功能衰竭、腎炎和其他因素引起的（圖 4c和 d）。

該研究主要探討合歡皮正丁醇提取物的毒性。與對照組比較，8 mg/kg組無顯著毒性反應(yīng)，肝和腎功能指標(biāo)無異常。但隨著ANE劑量增加到40 mg/kg，肝腎等內(nèi)臟器官開始受到毒性反應(yīng)影響。