基因芯片技術(shù)篩選HBV感染對(duì)肝癌細(xì)胞耐藥突變的影響分析

張 毅 雷彩紅 魯峰剛

肝癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤，稱之為癌癥之王，有著較高發(fā)病率及死亡率，其中死亡率位于腫瘤死亡率的第3位。近幾年來(lái)，肝癌的高發(fā)年齡已提前到35～50歲，呈現(xiàn)年輕化[1-2]。迄今為止，肝癌的發(fā)病機(jī)制及病因還不清楚，進(jìn)而給治療及預(yù)防帶來(lái)了困難。因此，如何解決肝癌的早期診斷及早期治療是肝膽外科醫(yī)師的重要任務(wù)?；熓侵委熗砥诟伟┲匾椒?，但是多藥耐藥限制了其療效。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)HBV在肝癌多藥耐藥發(fā)生及發(fā)展中有一定作用。本文為了進(jìn)一步分析HBV感染對(duì)肝癌細(xì)胞耐藥突變的影響，特采用基因芯片技術(shù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞，由某醫(yī)院提供HepG2.2.15細(xì)胞。基因芯片為Affymetrix的 Gene Chip primeview human。由Gene Chip HybridizationWash and Stain Kit提供洗滌和染色時(shí)機(jī)盒。由Life Technologies 公司提供 Agilent RNA 6000 Nano試劑盒；由Life Technologies公司提供PCR 試劑 Power SYBRGreen PCR Master Mix。由Invitrogen公司提供PCR引物。

1.2 方法

采用濃度為100 g/l胎牛血清的DMEM制作肝癌細(xì)胞株HepG2與HepG2.2.15，將其置于37 ℃下，體積分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，生長(zhǎng)在60%～80%時(shí)融合待于實(shí)驗(yàn)使用。采用Trizol 法進(jìn)行樣品的總RNA抽提，抽提之后的總RNA送到生物公司使用并進(jìn)行質(zhì)檢，合格樣本進(jìn)入到基因芯片及Real time-PCR實(shí)驗(yàn)。質(zhì)檢合格之后的RNA樣品采用基因芯片技術(shù)進(jìn)行分析，篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置：P<0.05，通過(guò)Gene Ontology功能軟件進(jìn)一步分析差異表達(dá)情況，選擇表達(dá)強(qiáng)的前10位。

2 結(jié)果

2.1 基因引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分析

基因引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1所示。

表1 基因引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分析

2.2 總RNA質(zhì)控

根據(jù)所提取的HepG2細(xì)胞及HepG2.2.15細(xì)胞總RNA，所提取的高純度RNA如下表2所示。

表2 RNA 樣本質(zhì)檢結(jié)果

2.3 藥物相關(guān)差異表達(dá)基因生物過(guò)程

通過(guò)Gene Ontolgy功能分析表達(dá)基因的生物過(guò)程，從中發(fā)現(xiàn)與藥物相關(guān)基因55個(gè)，上調(diào)基因數(shù)30個(gè)，下調(diào)基因數(shù)25個(gè)。包括與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖、藥物代謝等相關(guān)基因，表達(dá)強(qiáng)的前10見(jiàn)表3、表4。

表3 上調(diào)基因功能富集分析

表4 下調(diào)基因功能富集分析

2.4 基因芯片中表達(dá)差異的基因

根據(jù)以往研究結(jié)果及此次差異表達(dá)基因，選擇其中4個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證，見(jiàn)表5，表明基因變化與基因芯片相一致，基因芯片結(jié)果具有可靠性。

表5 差異表達(dá)基因的PCR驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

肝癌多發(fā)生于40～50歲，且男性發(fā)生率高于女性。迄今為止，原發(fā)性肝癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，在臨床中多表現(xiàn)為肝區(qū)疼痛、肝大、全身及消化道癥狀，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及身體健康[3]。長(zhǎng)期以來(lái)，臨床學(xué)者對(duì)肝癌的研究集中于1個(gè)或者幾個(gè)基因上，并表明免疫組化、Soutern等雜交技術(shù)無(wú)法滿足當(dāng)前高通量雜交要求。高通量基因表達(dá)譜芯技術(shù)被認(rèn)為是當(dāng)前腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移基因表達(dá)的有效工具?；蛐酒夹g(shù)是1種新型技術(shù)，被廣泛用于基因表達(dá)譜分析、多靶位同步超高通量藥物篩選上。以往研究表明：肝癌多藥耐藥涉及有多基因、多階段參與，且已證實(shí)HBV參與到多耐藥基因的調(diào)控中，但機(jī)制并未明確[4]。本次研究中，將基因芯片表達(dá)技術(shù)用于研究HBV感染對(duì)肝癌細(xì)胞耐藥突變的影響中，發(fā)現(xiàn)基因功能與基因間存在相互關(guān)系。利用基因芯片技術(shù)得到相關(guān)基因達(dá)到60多個(gè)，且涉及到的細(xì)胞種類有細(xì)胞周期調(diào)控基因、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因、藥物代謝相關(guān)基因、細(xì)胞增值相關(guān)基因等。

此次研究中，藥物相關(guān)基因55個(gè)，上調(diào)基因數(shù)30個(gè)，下調(diào)基因數(shù)25個(gè)。上調(diào)與下調(diào)基因多涉及細(xì)胞代謝、分化、編碼細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、編碼、轉(zhuǎn)錄、分解、凋亡等過(guò)程相關(guān)[5]。本研究結(jié)果表明，藥物相關(guān)基因上調(diào)最為明顯基因是CDH1、SEMA3C和FOS 等。CDH1是E鈣黏蛋白的編碼基因，其出現(xiàn)過(guò)甲基化會(huì)導(dǎo)致功能異常，引發(fā)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和耐藥等。SEMA3C在肝癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。體外細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，SEMA3C通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路影響細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移[6]。原癌基因c-FOS 能夠通過(guò)和c-JUN、ATF/CREB等形成異源二聚體，特異性的識(shí)別DNA序列，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，在腫瘤中起重要作用。近年來(lái)，原癌基因c-FOS在腫瘤耐藥中的作用備受關(guān)注，為多藥耐藥相關(guān)的分子機(jī)制提供了新的希望。

本研究顯示，與藥物下調(diào)相關(guān)的的基因有ABCG2、ARG1 和CYP1A1等。ABCG2在多種實(shí)體瘤中均有表達(dá)，且與多藥耐藥有關(guān)，但作用機(jī)制還不清楚[7-8]。ARG1是新的肝癌免疫標(biāo)志物，有研究表明[9]，轉(zhuǎn)染ARG1的293T細(xì)胞能夠誘導(dǎo)MrP和GST耐藥基因表達(dá)，可能成為腫瘤耐藥新靶點(diǎn)。CYP1A1是CYP450酶系中的重要成員之一，能夠間接參與腫瘤的發(fā)生，在肝臟可被高度誘導(dǎo)[10]。M1和M2多態(tài)性是目前對(duì)CYPIAI基因的研究與腫瘤易感性相關(guān)的主要基因[11]。研究表明[12]：CYPIAI基因MSP或者lie-val變異在吸煙人群中増加了患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)，但是在非吸煙人群中不增加，這說(shuō)明CYPIAI基因多態(tài)性在PAHs引起肝癌的過(guò)程中起著重要的作用。本次研究中發(fā)現(xiàn)CYPIAI基因下調(diào)，可能是由于在癌變發(fā)展過(guò)程中基因轉(zhuǎn)錄活性的改變，而在腫瘤不同部位中基因的改變有其特異性。既往研究表明，肝癌多藥耐藥與ABCB1、MrP2、LrP 和GST-pi 異常表達(dá)相關(guān)[13]。本實(shí)驗(yàn)采用Realtime-PCR檢測(cè)了上述基因在Hep G2.2.15及Hep G2中的表達(dá)，再次驗(yàn)證HBV參與了肝癌多藥耐藥的調(diào)節(jié)，同時(shí)也表明基因芯片結(jié)果可信[14]。

綜上所述，基因芯片技術(shù)正廣泛地應(yīng)用于肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程的研究，通過(guò)基因表達(dá)譜的分析來(lái)認(rèn)識(shí)肝癌的發(fā)病機(jī)制，對(duì)原發(fā)性肝癌有了更為理性的認(rèn)識(shí)。肝癌是個(gè)多基因、多環(huán)節(jié)、多途徑參與的過(guò)程，可能涉及影響不同生化途徑多群遺傳因子表達(dá)的改變。