低溫脅迫下核桃枝條抗寒性綜合評價

吳碩，賈彥麗，智福軍

(河北省農林科學院 石家莊果樹研究所，河北 石家莊 050061)

核桃 (JuglansregiaL.) 為胡桃科胡桃屬落葉喬木，其果實可作干果，又可作油料，是重要的木本油料樹種[1-2]。低溫傷害是北方核桃生產中存在的主要問題，尤其核桃幼樹，枝條髓心大、含水量高，極易遭受凍害影響[3-6]。近年來，隨著全球變暖帶來的極端氣候頻發(fā)，凍害發(fā)生普遍且有加重趨勢，已成為制約核桃生產的突出問題[7-9]。因此評價和篩選抗凍核桃品種對于核桃生產的防凍減災和抗凍育種都有重要的指導意義。

前人研究發(fā)現(xiàn)，核桃莖葉的組織結構、胞膜透性、細胞結構緊密度可以作為核桃品種抗寒性鑒定的預選指標[6-7，10]。在低溫條件下，植物膜透性、電導率、組織含水量、滲透調節(jié)物質(可溶性糖和可溶性蛋白等)以及保護酶活性等都會發(fā)生變化[11-14]，抗凍和易受凍害品種的物質含量和變化趨勢顯著不同，可以作為品種抗寒性評價標準。

本研究擬評價2個從贊皇優(yōu)選的抗凍核桃品系，通過與已知的較抗寒品種遼寧1號和抗寒性較差的清香品種在不同低溫處理下，對比與抗寒性相關的各項保護酶活性和滲透調節(jié)物質指標，分析抗寒性生理生化指標含量和變化規(guī)律，明確優(yōu)選試材抗寒性，為篩選抗凍核桃品種及抗凍育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年12月11日，在贊皇嶂石巖下北莊采集贊核1號(Ⅰ)和贊核2號(Ⅱ)2個核桃優(yōu)系，以及較抗寒品種遼寧1號(Ⅲ)和較不抗寒品種清香(Ⅳ)2個品種的1 a生無病蟲害、無機械損傷的枝條，帶回石家莊果樹研究所中心實驗室內。

將采集的枝條剪成25 cm的枝段，用自來水沖洗數(shù)遍，洗掉泥土、灰塵，再用蒸餾水沖洗 3次，用潔凈的紗布擦干水分，保鮮袋封裝備用。每個品種(系)的枝條分成等份的4份，每份10根。處理溫度設置為CK(對照，0 ℃)，-10 ℃，-20 ℃和-30 ℃，以-5 ℃每小時降溫，降至所設溫度后維持12 h，然后以5 ℃每小時升溫至0 ℃。每處理重復3次。

1.2 試驗方法

將處理后枝條，剪成1～2 mm碎片，混勻后液氮速凍，錫紙包裹后裝保鮮袋-70 ℃保存。用蘇州科銘生物技術有限公司的試劑盒測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、可溶性糖和可溶性蛋白含量。

2 結果與分析

2.1 低溫對核桃1 a生枝條SOD活性的影響

超氧化物歧化酶(簡稱SOD)能夠催化超氧化物通過歧化反應轉化為氧氣和過氧化氫的酶。環(huán)境脅迫可造成體內抗氧化酶系統(tǒng)紊亂，SOD酶活性下降，活性氧自由基大量積累，膜完整性下降。因此。SOD活性與植物逆境下抗逆能力密切相關。核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下SOD活性變化情況見圖1。

圖1 核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下SOD活性變化Figure 1 Changes of SOD activity in annual branches of walnut under different temperature stress

由圖1可知，4個品種(系)1 a生枝條隨溫度下降變化趨勢不同，其中Ⅰ和Ⅱ變化相似，隨溫度變化，呈現(xiàn)升-降-升的趨勢。Ⅲ在0 ℃至-20 ℃變化趨勢與Ⅰ和Ⅱ相同，但在溫度由-20 ℃降至-30 ℃時，SOD酶活性仍呈下降趨勢。Ⅳ變化趨勢則與其余品種相反，呈現(xiàn)降-升-降的變化趨勢。

在0 ℃時，Ⅳ SOD活性顯著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，為325 U/g。隨溫度下降，I活性變化不顯著，變化幅度僅為20 U/g。在-10 ℃時I和ⅢSOD酶活性達到頂峰，分別為204 U/g和223 U/g。Ⅱ在-30℃時酶活性最高，為201 U/g。

在0 ℃時Ⅳ的 SOD活性顯著高于其余品種(系)，表明SOD酶活性已經被激活，用于消除低溫帶來的活性氧傷害。也表明Ⅳ受低溫凍傷程度明顯高于其余品種(系)。此后隨溫度下降，Ⅳ的SOD活性均低于0 ℃時，表明低溫已對其造成傷害，部分細胞受到凍害，SOD活性下降。Ⅰ、Ⅲ和Ⅱ的SOD活性分別在-10 ℃和-30 ℃達到峰值，表明在此溫度下SOD活性被完全激發(fā)，表明其抗寒能力均高于0 ℃時達到峰值的Ⅳ。

2.2 低溫對核桃1 a生枝條CAT活性的影響

過氧化氫(Hydrogenperoxide，H2O2)是生物細胞代謝過程中產生的一種活性氧。逆境脅迫下，活性氧的產生量超過系統(tǒng)清除能力，由此造成氧化損傷。植物在低溫脅迫下，體內CAT酶活性代表植物對低溫的抗性能力。核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下CAT活性變化情況見圖2。

圖2 核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下CAT活性變化Figure 2 Changes of CAT activity in annual branches of walnut under different temperature stress

由圖2可知，在低溫脅迫下，4個品種(系)枝條中CAT活性同SOD活性一致，呈現(xiàn)出2種不同的變化趨勢。其中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ變化趨勢相同，CAT活性隨低溫脅迫的加劇呈逐步增加的趨勢。Ⅳ的CAT含量變化趨勢相反，隨溫度下降而下降，且隨溫度下降，CAT活性不升反降，可能是枝條隨溫度下降，受凍嚴重且部分細胞死亡，酶含量下降活性降低。

在0 ℃時Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的CAT活性都為0，可能是此時酶活性較低，測試試劑盒檢測靈敏度不夠，故未測得CAT活性。但此時Ⅳ的CAT含量最高，為52 nmol/(min·g)，表明此溫度下枝條已受到了凍害，CAT酶活性被激發(fā)出來清除低溫產生的活性氧傷害。溫度下降到-10 ℃時，Ⅲ的CAT活性高于I和Ⅱ，此時酶活性為Ⅳ>Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ。當溫度下降到-20 ℃時，Ⅲ變化趨緩，而I的CAT活性明顯增加。Ⅱ在0～-30 ℃之間CAT含量上升較平緩，一直處于較低水平。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的CAT活性在-30 ℃達到峰值，分別為21 nmol/(min·g)、19 nmol/(min·g)和25 nmol/(min·g)，表明此溫度下低溫對其傷害加重，枝條的CAT活性被完全激發(fā)抵抗凍害，枝條有較好的抗寒性能。

2.3 低溫對核桃1 a生枝條POD活性的影響

過氧化物酶(POD)是協(xié)同SOD和CAT，共同清除自由基的酶。核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下POD活性變化情況見圖3。

圖3 核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下POD活性變化Figure 3 Changes of POD activity in annual branches of walnut under different temperature stress

由圖3可知，4個品種(系)1 a生枝條隨溫度下降POD活性變化與SOD和CAT基本一致，也呈現(xiàn)2種不同的趨勢。I、Ⅱ和Ⅲ的POD活性隨溫度下降呈現(xiàn)升-降-升的趨勢。而Ⅳ呈現(xiàn)出相反的變化趨勢，為降-升-降。

在0 ℃時，I、Ⅱ和Ⅲ的POD活性均為25 U/(g·min)，高于Ⅳ19 U/(g·min)。I、Ⅱ和Ⅲ的 POD活性在-10 ℃時出現(xiàn)最高值，分別為33 U/(g·min)、32 U/(g·min)和33 U/(g·min)。而Ⅳ的POD活性最高值出現(xiàn)在-20 ℃時，為34 U/(g·min)，活性最低值為-30℃時，9 U/(g·min)。

2.4 低溫對核桃1 a生枝條MDA活性的影響

丙二醛含量是植物細胞膜質過氧化程度的體現(xiàn)。丙二醛含量高，說明植物細胞膜質過氧化程度高，細胞膜受到的傷害嚴重。一般植物在逆境條件下，如高溫、鹽堿以及強光等逆境條件下就會產生膜質過氧化。核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下MDA含量變化情況見圖4。

圖4 核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下MDA含量變化Figure 4 Changes of MDA content in annual branches of walnuts under different temperature stress

由圖4可知，4個核桃品種(系)1 a生枝條的MDA含量變化趨勢一致，均為隨溫度下降而先升后降，變化趨勢為緩-急-平。在-10 ℃至-20 ℃時，MDA含量呈現(xiàn)明顯增加。4個核桃品種(系)的峰值均為-20 ℃時，分別為43 nmol/g、44 nmol/g、40 nmol/g和45 nmol/g。在各個溫度下4個核桃品種(系)均表現(xiàn)為Ⅳ>Ⅱ> Ⅰ >Ⅲ。

2.5 低溫對核桃1 a生枝條可溶性糖含量的影響

可溶性糖是維持細胞穩(wěn)定性的指標，可溶性糖含量越高，細胞越不易失水，抗性越強。核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下可溶性糖含量變化情況見圖5。

圖5 核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下可溶性糖含量變化Figure 5 Changes of soluble sugar content in annual branches of walnuts under different temperature stress

由圖5可知，隨溫度下降，4個核桃品種(系)1 a生枝條呈現(xiàn)2種不同的變化趨勢，其中I、Ⅱ和Ⅳ變化趨勢一致，為降-升-降。而Ⅲ則呈現(xiàn)先升后降的趨勢。

不同的低溫處理對4個核桃品種(系)1 a生枝條的可溶性糖含量的影響不大，變化范圍在20～42 μg/g之間，多數(shù)集中于25～35 μg/g之間。表明隨著溫度的降低，可溶性糖含量變化在相對小的范圍內變化。在0 ℃時Ⅱ可溶性糖含量最高，為42 μg/g。I和Ⅲ分別在-20 ℃和-10 ℃含量達到峰值，分別為35 μg/g和36 μg/g。在各溫度下，Ⅳ含量均顯著低于其余各品種。

2.6 低溫對核桃1 a生枝條可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白可以作為滲透調節(jié)物質使細胞維持一定的膨壓，保證植物氣孔運動和光合作用等生理過程的正常進行。核桃 1 a生枝條在不同溫度脅迫下可溶性蛋白含量變化情況見圖6。

圖6 核桃1 a生枝條在不同溫度脅迫下可溶性蛋白含量變化Figure 6 Changes of soluble protein content in annual branches of walnuts under different temperature stress

由圖6可知， 4個核桃品種(系)1 a生枝條變化趨勢基本一致，在0～-30 ℃之間呈現(xiàn)降-升-降的變化趨勢，僅Ⅲ在0～-10 ℃之間呈微弱的上升趨勢。各品種(系)可溶性蛋白含量均在-20℃達到峰值。

在0 ℃時，可溶性蛋白含量為Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅳ，而在其余溫度時，均為Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ>Ⅳ。在低溫脅迫下，Ⅲ的可溶性蛋白含量增幅最大，說明其對低溫應激反應最強。其次依次為Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ。Ⅳ可溶性蛋白含量隨溫度下降變化幅度最小，僅為14 μg/g，表現(xiàn)為對溫度脅迫較不敏感。

3 結論

贊核1號、贊核2號、遼寧1號和清香4個核桃品種(系)在0 ℃、-10 ℃、-20 ℃和-30 ℃下，保護酶(POD、CAT、SOD等)和滲透調節(jié)物質(如可溶性糖和可溶性蛋白等)變化不盡相同。呈現(xiàn)出2類變化趨勢：第1類為贊核1號、贊核2號、遼寧1號變化趨勢相同，且與清香變化趨勢相反。具體表現(xiàn)在負載清除自由基，保護細胞膜完整性的SOD、POD和CAT活性上。其中SOD和POD呈現(xiàn)相同的變化規(guī)律，均為贊核1號、贊核2號和遼寧1號隨溫度下降表現(xiàn)為升-降-升的變化趨勢，而清香變化趨勢與其變化相反。CAT活性隨溫度的變化也呈現(xiàn)2種不同的變化趨勢，同樣為贊核1號、贊核2號和遼寧1號變化相同，隨溫度下降而酶活性上升，清香的變化趨勢則相反，隨溫度下降而下降。第2類為4個核桃品種(系)變化趨勢相同，表現(xiàn)在滲透調節(jié)物質的MDA、可溶性糖和可溶性蛋白含量上。其中4個核桃品種(系)的MDA含量均隨溫度溫度下降而上升，而可溶性蛋白含量呈現(xiàn)隨溫度下降而降-升-降。4個核桃品種(系)可溶性糖含量呈現(xiàn)大體一致的變化趨勢，含量隨溫度下降呈現(xiàn)降-升-降，僅在0 ℃到-10 ℃時，遼寧1號呈現(xiàn)輕微上升趨勢。

對比4個核桃品種(系)各酶活性和物質含量可見，贊核1號和贊核2號多介于遼寧1號和清香之間，且贊核2號數(shù)值趨近于遼寧1號，而贊核1號數(shù)值多趨近于清香，但贊核1號和贊核2號數(shù)值差異極小。由此可推斷出，贊核系列抗寒性介于遼寧1號和清香之間。且贊核系列酶活性和物質含量與遼寧1號變化趨勢較為相似，而與清香變化差異較大，表現(xiàn)出贊核系列有良好的抗寒性能。