人乳頭瘤病毒16型DNA整合對(duì)宮頸癌變的影響*

劉霞，張喬，張慧杰

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 沈陽(yáng)110004）

子宮頸癌是全球范圍內(nèi)第4 位常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]，持續(xù)性高危型人乳頭瘤病毒（high-risk human papilloma virus, HR-HPV）感染是導(dǎo)致子宮頸鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）及其癌前病變發(fā)生的必要但不充分病因[1-2]。目前SCC 發(fā)生的模式按照以下步驟進(jìn)行： 急性HR-HPV 感染，持續(xù)性HRHPV 感染導(dǎo)致不同程度的子宮頸上皮細(xì)胞異常，包括子宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）Ⅰ～Ⅲ級(jí)；或2 級(jí)分類系統(tǒng)的宮頸低級(jí)別和高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade/high-grade squamous intraepithelial lesions, LSIL/HSIL），最終進(jìn)展為浸潤(rùn)性SCC[3]。子宮頸癌發(fā)生的機(jī)制尚不完全清楚，一些病毒和宿主的基因事件可能促進(jìn)正常宮頸上皮向惡性腫瘤的轉(zhuǎn)變[2，4-5]。HPV 基因組在宮頸組織中以3 種形式存在（環(huán)狀游離型，整合到宿主基因組中，或者兩者共存的混合型）[4-6]。整合發(fā)生在HPV 病毒致癌基因E6、E7的下游，通常在E2或E1基因區(qū)域[1]；HPV DNA 整合到宿主細(xì)胞基因組后，癌基因E6、E7和長(zhǎng)控制區(qū)域（long control region, LCR）通常被保留,而E2基因優(yōu)先被刪除或破壞[4]。因此，E2、E6基因的比值（E2/E6）被提出可作為評(píng)估HPV 基因組整合的替代標(biāo)志物[7-8]。HR-HPV 基因組整合后由于E2 蛋白負(fù)調(diào)控功能的喪失，通常導(dǎo)致E6、E7癌基因的表達(dá)失調(diào)，因此病毒整合可能參與HPV-相關(guān)腫瘤的致癌過(guò)程。

HPV-16 是SCC 及其癌前病變（CIN Ⅱ/Ⅲ或HSIL）中最常見(jiàn)的高危因素[4，9]。已有的關(guān)于HPV-16整合在宮頸病變中的作用尚存在爭(zhēng)議。一些研究表明，HPV 整合與宮頸病變的嚴(yán)重程度相關(guān)[1，4，10]，而另一些研究則相反[11-12]。此外，一些學(xué)者認(rèn)為HPV整合是發(fā)生病毒感染過(guò)程的早期事件，即發(fā)生在LSIL或正常宮頸上皮細(xì)胞中[11，13]，而另一些學(xué)者認(rèn)為病毒整合是與從HSIL 進(jìn)展到SCC 相關(guān)的晚期事件[14]。HPV 基因組的整合率隨病毒感染的型別、部位、疾病的嚴(yán)重程度或其他的生物-地理因素而變化[4，7]。該研究采用多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)[8，11]對(duì)來(lái)自中國(guó)東北地區(qū)428 例HPV-16 陽(yáng)性的不同級(jí)別宮頸病變及正常宮頸上皮女性的宮頸脫落細(xì)胞中HPV-16 DNA 的整合狀況進(jìn)行全面分析，探討其與子宮頸病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性及其在宮頸癌變中發(fā)揮的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年8月—2017年12月于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦科進(jìn)行宮頸癌篩查HPV-16 的婦女428 例。研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者簽署知情同意書。

研究對(duì)象分為病例組354 例，包括經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)SCC 組103 例，HSIL 組（CIN Ⅱ/Ⅲ）251 例。對(duì)照組74 例，包括經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)的34 例LSIL組（CIN Ⅰ）和40 例正常宮頸上皮組（因良性婦科腫瘤行子宮切除術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)排除宮頸病變的女性）。在收集宮頸脫落細(xì)胞時(shí)患者年齡18 ～67 歲，平均（38.9±8.8）歲。對(duì)患者進(jìn)行如下檢測(cè)： 常規(guī)婦科檢查，Thin Prep ?細(xì)胞學(xué)檢測(cè)（TCT）及HPV 分型檢測(cè)。宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本采用錐形宮頸刷取樣，宮頸細(xì)胞學(xué)標(biāo)本取樣步驟和要求按照常規(guī)進(jìn)行。用窺器輕輕暴露宮頸后，先用棉拭子拭凈宮頸表面分泌物，將宮頸刷置于子宮頸管內(nèi)達(dá)子宮頸上方1.0 cm 左右的宮頸鱗柱交界處取樣，宮頸刷在子宮頸管內(nèi)旋轉(zhuǎn)3 ～5圈后取出，將刷取的宮頸脫落細(xì)胞洗脫于1 個(gè)包含20 ml Preserv Cyt 溶液的小瓶中，細(xì)胞標(biāo)本放置在保存液中2 周內(nèi)檢測(cè)，4℃冰箱保存。經(jīng)Thin Prep ? 2000系統(tǒng)程序化處理宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本，制成直徑2 cm的薄層細(xì)胞涂片，采用巴氏染色[15]。所有標(biāo)本在宮頸活檢或治療前采樣。采用2001年TBS 系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果分類： 上皮內(nèi)病變惡性腫瘤陰性（negative for intraepithelial lesion malignancy, NILM），意義未明非典型鱗狀細(xì)胞（atypical squamous cells of undetermined significance, ASC-US），非典型鱗狀細(xì)胞伴不能排除高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（atypical squamous cells with high-grade lesion that cannot be excluded, ASC-H） 或LSIL 及HSIL。剩余標(biāo)本置入-20℃冰箱冷凍保存，2個(gè)月提取DNA 用于HPV 分型檢測(cè)?；颊呔哂忻庖呷毕菁膊∈贰⑷焉?、盆腔化療或放療病史，或?qū)m頸治療或活檢病史不包括在該研究中。

1.2 材料與試劑

Thin Prep ? 2000 細(xì)胞學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)（TCT）（美國(guó)Cytyc 公司），QIAamp DNA 提取試劑盒（德國(guó)Qiagen Hilden 公司），SiHa 宮頸癌細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)培養(yǎng)中心（美國(guó)ATCC 公司），HeLa 細(xì)胞株（由該院感染科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)），10%胎牛血清（德國(guó)Gibco Chrome 公司），100 bp DNA 梯度（美國(guó) Invitrogen 公司），TaqMan 多重PCR 試劑盒（北京TIANGEN 生物技術(shù)有限公司)。

1.3 儀器與設(shè)備

HPV 分型檢測(cè)采用凱普HPV Geno Array 技術(shù)（香港Hybri Bio 有限公司），PCR 循環(huán)儀（德國(guó)Eppendorf Master-cycler Gradient 公司），臺(tái)式高速離心機(jī)（TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠），LDZ5-2 低速離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司），紫外分光光度儀（美國(guó)Beckman Coulter 公司）；電泳圖像掃描儀（Tanon 4100）（上海天能公司），Primer Premier 5.0 軟件（加拿大Premier 公司），Stata 11.1 軟件（美國(guó)Stata 公司），電泳圖像分析軟件（美國(guó)Bio Image Ann Arbor Mich公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.4.1 細(xì)胞株培養(yǎng)及細(xì)胞DNA 提取SiHa 宮頸癌細(xì)胞株含有1、2 個(gè)整合的HPV-16 用于多重PCR的陽(yáng)性對(duì)照。HeLa 細(xì)胞株含有1 個(gè)整合的HPV-18 DNA 作為陰性對(duì)照。SiHa 和HeLa 細(xì)胞在改良的DMEM 和RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別補(bǔ)充10%胎牛血清，在37℃、飽和濕度、5%二氧化碳CO2標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)。

從宮頸脫落細(xì)胞及細(xì)胞株中提取總的細(xì)胞DNA，采用DNA 試劑盒進(jìn)行，從細(xì)胞保存液中提取3 ml經(jīng)離心后用于DNA 制備；采用紫外分光光度計(jì)在OD260/280 處測(cè)定DNA 濃度。通過(guò)擴(kuò)增3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）基因確定存在人基因組DNA。只有GAPDH擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)一步行HPV 分型檢測(cè)[15]。

1.4.2 HPV 分型檢測(cè)、陰道鏡和組織學(xué)診斷HPV基因分型檢測(cè)采用核酸分子快速導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)，該技術(shù)能同時(shí)檢測(cè)21 種HPV 基因型，包括6 種低危型HPV（low-risk HPV, LR-HPV）類型（6，11，42，43，44 型和CP8304 相當(dāng)于81 型），14 種HR-HPV類 型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66 和68 型）和1種可能HR-HPV 型53?；驹硎窍葘PV DNA 進(jìn)行基因擴(kuò)增，然后利用其特有專利的導(dǎo)流雜交技術(shù)使目的分子導(dǎo)流穿過(guò)固定有DNA 探針的基因芯片薄膜進(jìn)行快速雜交。具體步驟包括： 樣本HPV DNA 分離、提取；PCR 擴(kuò)增；核酸分子快速導(dǎo)流雜交、顯色；最終的結(jié)果分析通過(guò)芯片的顏色變化直接進(jìn)行肉眼判讀[15]。

HPV-16 陽(yáng)性的患者，無(wú)論其宮頸細(xì)胞學(xué)結(jié)果如何，均轉(zhuǎn)診陰道鏡。陰道鏡檢查后在任何可疑宮頸病變區(qū)域進(jìn)行點(diǎn)活檢。對(duì)不滿意陰道鏡檢查，進(jìn)一步行子宮頸管內(nèi)膜搔刮術(shù)（endocervical curettage,ECC）。組織學(xué)診斷在宮頸脫落細(xì)胞取樣后3 個(gè)月內(nèi)獲得。宮頸組織標(biāo)本是通過(guò)宮頸活檢，環(huán)狀電切（loop electrosurgical excision procedures, LEEP）錐型切除或全子宮切除獲得。對(duì)具有多個(gè)組織學(xué)診斷的患者，以最嚴(yán)重的診斷為最終結(jié)果。所有組織學(xué)切片均由該院2 位病理醫(yī)師盲法審閱。如果前2 位病理醫(yī)師的診斷不一致，由第3 位病理醫(yī)生盲法審閱病理切片。多數(shù)病理醫(yī)生的判定結(jié)果作為最終的診斷。

1.4.3 多重PCR 檢測(cè)HPV-16 基因組的體內(nèi)狀態(tài)HPV-16 基因組的體內(nèi)狀態(tài)用多重PCR 法進(jìn)行盲法分析。如果E2/E6的比值是0，則HPV DNA 認(rèn)為是“純整合”型；如果比值≥1 是純游離型，如果比值為0 ～＜1 是混合型[4，16]。

針對(duì)HPV-16E2和E6基因的多重PCR 是在一個(gè)反應(yīng)試管內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增E2和E6基因，擴(kuò)增在25 μl終反應(yīng)混合物中進(jìn)行： 包含2.5 μl 的樣本DNA，每個(gè)引物0.25 μmol，10×PCR 緩沖液2.25 μl，2 μl dNTPs，0.20 μl TaqMan（5 u/μl）和17.05 μl ddH2O。循環(huán)條件是94℃預(yù)變性5 min，隨后30 個(gè)周期為94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，最終72℃繼續(xù)延伸5 min。

HPV-16E2和E6的引物用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增HPV-16E2和E6基因的引物見(jiàn)表1。擴(kuò)增后，5 μl 多重PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，用100 bp DNA 梯度標(biāo)記,然后在紫外線（UV）下顯影。測(cè)量并分析E2和E6基因擴(kuò)增條帶的面積和灰度，然后計(jì)算E2/E6基因的比值。每個(gè)樣本檢測(cè)一式3 份。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Stata 11.1 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；不同級(jí)別宮頸病變中HPV DNA 整合率的變化采用χ2趨勢(shì)分析；HPV-16 DNA 整合與現(xiàn)患≥HSIL 病變風(fēng)險(xiǎn)采用多因素非條件Logistic 回歸分析；SCC 相關(guān)因素采用Logistic 回歸分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 多重PCR 的引物

2 結(jié)果

2.1 兩組SCC 相關(guān)因素的比較

患者平均年齡： 病例組（37.1±4.0）歲，對(duì)照組（36.9±3.9）歲。兩組年齡、使用激素避孕藥、終生男性伴數(shù)、同時(shí)感染其他高危型比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組吸煙狀況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），病例組多于對(duì)照組。見(jiàn)表2。

2.2 不同級(jí)別宮頸上皮細(xì)胞HPV-16 DNA 的整合狀況

病毒的整合率隨宮頸病變的嚴(yán)重程度的加重而升高（χ2=78.096，P=0.000）。HPV-16 DNA 的整合率（即混合型例數(shù)+純粹整合型例數(shù)/總病例數(shù)）從對(duì)照組的6.8%（5/74）上升到HSIL 組中的29.9%（75/251）及SCC 組中的68.0%（70/103）[HSIL 組與SCC 組比較（χ2=43.796，P=0.000），病例組與對(duì)照組比較（χ2=31.455，P=0.000），LSIL 組與HSIL 組比較（χ2=6.679，P=0.008）]。在SCC 組 中，HSIL 及LSIL 整合型HPV-16 DNA 均以混合型為主。整合型的HPV-16 DNA 在SCC 女性中最常見(jiàn)，并且在32.0%（33/103）的SCC 患者中檢測(cè)到純粹游離型。該研究檢測(cè)到的純粹游離型及混合型HPV-16 DNA 的E2/E6基因比值范圍分別為1.00 ～2.34 和0.42 ～0.98。見(jiàn)圖1和表3。

表2 兩組SCC 相關(guān)因素的比較 例（%）

2.3 HPV-16 DNA 整合與宮頸病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性

SCC 組、HSIL 組及對(duì)照組HPV-16 基因組整合率的變化趨勢(shì)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=8.530，P=0.000）。

圖1 HPV-16 E2、E6 基因電泳結(jié)果

表3 不同宮頸病變程度HPV-16 DNA 體內(nèi)狀態(tài)

HPV-16 DNA 整合與現(xiàn)患HSIL 或SCC 風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性采用非條件Logistic 回歸分析，因變量（Y）是組織病理學(xué)結(jié)果；將吸煙狀態(tài)和同時(shí)感染其他HR-HPV型別納入多變量分析模型（α=0.10）。Logistic 回歸分析顯示調(diào)整吸煙狀態(tài)及合并感染其他類型HR-HPV因素后，HPV-16 DNA 整合與現(xiàn)患HSIL 或SCC 風(fēng)險(xiǎn)的=2.30（95% CI： 1.62，3.18）。

3 討論

該研究結(jié)果顯示，HPV-16 DNA 整合率隨宮頸病變的加重而升高，這一結(jié)果與已有的一些研究報(bào)道相一致[7，16]。本研究在組織病理學(xué)證實(shí)的不同級(jí)別宮頸上皮細(xì)胞中進(jìn)一步分析HPV-16 DNA 的整合狀況，非條件Logistic 回歸結(jié)果顯示HPV-16 基因組整合與現(xiàn)患HSIL 或SCC 的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，進(jìn)一步支持病毒整合促進(jìn)HPV-相關(guān)腫瘤癌變的結(jié)論[4，6]。HPV 基因組整合很可能是通過(guò)促進(jìn)HPV 持續(xù)性感染，以及病毒整合后E2 負(fù)反饋調(diào)節(jié)蛋白功能的喪失，引起E6、E7癌基因表達(dá)失調(diào)，從而促進(jìn)子宮頸上皮癌變的發(fā)生。另外，該研究結(jié)果顯示相當(dāng)一部分（32.0%）SCC 女性僅含有純粹游離型的HPV-16 基因組，這與文獻(xiàn)報(bào)道的比例（24.7%～34.0%）相似[2，17]。目前關(guān)于宮頸癌發(fā)生的潛在機(jī)制尚未完全闡明，有研究結(jié)果進(jìn)一步支持HPV 基因組整合并非是宮頸癌發(fā)生的必要因素這一觀點(diǎn)[17]。一些研究顯示在具有純粹游離型HPV DNA的腫瘤中，整合部位的基因或表觀遺傳調(diào)控可能導(dǎo)致E6、E7致癌基因表達(dá)失調(diào)[6，18]。表明盡管在宮頸癌中通常能檢測(cè)到病毒整合，但病毒整合在宮頸癌變過(guò)程中并非是先決條件。因此，進(jìn)一步研究與HPV 整合相關(guān)的宮頸癌發(fā)生的具體作用機(jī)制，如免疫逃逸相關(guān)的機(jī)制及整合部位的基因或表觀遺傳調(diào)控等機(jī)制將為深入闡明HPV-相關(guān)腫瘤的發(fā)病機(jī)制提供更為有價(jià)值的信息。

另外，該研究顯示在組織學(xué)證實(shí)的LSIL 及正常宮頸上皮細(xì)胞中均能檢測(cè)到整合型HPV-16 基因組，該結(jié)果進(jìn)一步證明病毒整合發(fā)生在HPV-16 感染自然史早期這一假設(shè)[8，13，16]。已報(bào)道的在LSIL 或正常宮頸上皮細(xì)胞中HPV-16 DNA 的整合率范圍波動(dòng)較大，從8.0%（5/62）[19]→28.2%（3/11）[20]→43.8%（7/16）→60.0%（3/5）[1，8]。該差異可能部分歸因于不同的生物-地理因素，如地理區(qū)域和研究人群或不同的檢測(cè)方法。

該研究的某些局限性如下。首先，采用多重PCR技術(shù)同時(shí)擴(kuò)增病毒E2、E6基因用E2/E6基因比值評(píng)估HPV-16 DNA 的整合狀態(tài)，已有研究表明該方法能更為準(zhǔn)確地確定HPV DNA 的體內(nèi)狀態(tài)，與單一PCR法相比能獲得更為可靠的E2/E6比值[7-8]。但鑒于宮頸脫落上皮細(xì)胞標(biāo)本可能是異常和正常上皮細(xì)胞的混合物，該方法不能區(qū)分哪種類型的宮頸上皮細(xì)胞含有整合型或純粹游離型病毒DNA，或者兩者共存于同一個(gè)宮頸細(xì)胞內(nèi)。因此，在未來(lái)的研究中采用單細(xì)胞水平分析HPV 感染狀態(tài)（即利用激光顯微切割分離出單個(gè)感染HPV 的細(xì)胞，然后進(jìn)行HPV DNA 分析），可能會(huì)為病毒整合在HPV-相關(guān)腫瘤發(fā)生機(jī)制中的作用研究提供更為有趣的線索。其次，HPV 基因組整合事件及其隨后的克隆選擇（即整合體具有轉(zhuǎn)錄活性）可能是2 個(gè)獨(dú)立的過(guò)程，該研究?jī)H分析病毒基因組的整合率，進(jìn)一步研究整合后的轉(zhuǎn)錄情況將有助于更好地理解病毒整合在宮頸病變進(jìn)展中的致癌機(jī)制。盡管如此，該研究的結(jié)果進(jìn)一步支持病毒整合促進(jìn)HPV-相關(guān)腫瘤癌變過(guò)程的結(jié)論。第三，該研究中采用E2/E6比值作為HPV DNA 整合的替代標(biāo)志物，鑒于E2基因是HPV DNA 整合的優(yōu)先區(qū)域；但HPV DNA 整合還可能涉及E1基因的刪除或斷裂[1]。因此，進(jìn)一步檢測(cè)E1 開(kāi)放閱讀框?qū)椴《菊显贖PV-相關(guān)腫瘤發(fā)生中的作用提供更為精準(zhǔn)的信息；并且為進(jìn)一步闡明與病毒整合相關(guān)的具體宮頸癌發(fā)病機(jī)制提供更有價(jià)值的相關(guān)信息。

綜上所述，HPV-16 DNA 的整合率隨宮頸病變的加重而升高，HPV-16 DNA 整合與現(xiàn)患HSIL 及以上病變的風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性，表明HPV-16 基因組整合發(fā)生在病毒感染自然史的早期，病毒整合在子宮頸癌變過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用。