代謝酶基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關系*

孔曉玲，張曉梅，洪偉偉，張琰，沈波，程艷萍，楊圣，梁戈玉

（1.東南大學 公共衛(wèi)生學院，江蘇 南京 210009；2.江蘇省腫瘤醫(yī)院，江蘇 南京 210009）

結(jié)腸直腸癌是世界上常見的癌癥類型之一[1]。近10年來，中國結(jié)直腸癌的發(fā)病率迅速上升[2]，據(jù)統(tǒng)計，2014年中國結(jié)腸直腸癌新發(fā)病例約37.0 萬，死亡病例約18.0 萬，分別居惡性腫瘤第3 和第5 位[3]。結(jié)直腸癌的發(fā)病和進展與個體遺傳差異密切相關，因此尋找與結(jié)直腸癌進展相關的分子生物學標志物能為判斷或預測腫瘤進展提供分子水平依據(jù)。代謝酶是生物體內(nèi)物質(zhì)代謝的重要組成部分，參與各種生命活動和過程。已有研究報道，代謝酶基因多態(tài)性可能影響基因、蛋白表達以及酶活性，影響物質(zhì)代謝過程，從而改變生物體的暴露，最終影響結(jié)直腸癌的發(fā)病、治療和預后。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase,GST）代表1個Ⅱ相解毒酶超家族，參與內(nèi)源外源活性物質(zhì)的代謝。其作用機制為GST 酶催化谷胱甘肽與親電物質(zhì)結(jié)合，使其轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性代謝物，從而消除有害物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)GST 酶可促進各種致癌物質(zhì)、治療藥物、環(huán)境毒素和氧化應激產(chǎn)物的解毒。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M3（GSTM3）rs7483 位于編碼區(qū)，該單核苷酸多態(tài)性（single nueleotide polymorphism,SNP）能影響GSTM3 酶活性[4]，但目前尚無GSTM3 rs7483 與結(jié)直腸癌進展的相關報道。二氫嘧啶脫氫酶（dihydropyrimidine dehydrogenase, DPD）由二氫嘧啶脫氫酶基因（dihydropyrimidine dehydrogenase gene, DPYD）編碼，是調(diào)節(jié)胸腺嘧啶或尿嘧啶等的第1 階段代謝酶，其代謝受阻可導致嚴重的毒性效應，如RNA 或DNA損傷[5]。rs1801159 是位于DPYD 編碼區(qū)的SNP，能導致密碼子543 處的異亮氨酸翻譯成纈氨酸。研究報道稱rs1801159 能降低DPD 活性，可能與結(jié)直腸癌的進展有關[6]。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（uridine diphosphate glucuronyltransferase, UGT）廣泛表達于肝臟、胃和腸道等組織。研究表明，當UGT基因發(fā)生變異，酶活性可能降低或喪失，導致內(nèi)外源性化合物與結(jié)腸黏膜組織葡萄糖醛酸的結(jié)合能力降低，解毒減少，致癌物的暴露增加，可能影響胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌等癌癥的發(fā)病、進展和預后[7-8]。

本研究通過NCBI dbSNP 數(shù)據(jù)庫，選擇與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展可能相關的代謝酶基因，并在中國漢族人群中選擇次要等位基因頻率（minor allele frequency,MAF）＞20%的3 個候選SNPs，分別是GSTM3 rs7483、DPYD rs1801159 和UDP 葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1 家族多 肽A1（UDP-glucuronosyltransferase 1A1, UGT1A1）rs3755319，研究候選SNPs 與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2016年1月—2017年7月江蘇省腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸癌患者外周血690 份。其中，男性427 例，女性263 例；平均年齡（57.83±11.64）歲；平均BMI（23.03±2.91）kg/m2。由于48 例缺少分化程度資料，只分析了642 例患者的基因多態(tài)性與分化程度的關系。納入標準： ①研究對象同意參加本研究；②經(jīng)組織病理學確診為結(jié)直腸癌患者；③年齡、性別不限。排除標準： ①同時患其他腫瘤或有腫瘤史者；②經(jīng)診斷患嚴重的消化道疾病或嚴重心腦血管疾病等疾病者。每人抽取2 ml 外周靜脈血于抗凝管，然后置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

QIAamp DNA Blood Mini Kit DNA 提取試劑盒（德國QIAGEN 公司），2×Hot Taq @ PCR Reaction Mix（美國Stegene Bio Technoloaies 公司），探針和引物由南京驥驁生物技術有限公司設計合成。Step One PlusTMPCR 儀（美國Applied Biosystems 公司），Nano Drop ND-1000 微量分光光度計（美國Thermo 公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取外周血基因組DNA使用QIAamp DNA Blood Mini Kit DNA 提取試劑盒從外周血中提取基因組DNA，操作過程按照說明書步驟進行，提取的DNA于-20℃冰箱冷凍保存。采用Nano Drop ND-1000 微量分光光度計測定DNA 濃度和純度。

1.3.2 基因分型采用TaqMan -MGB實時熒光定量PCR法進行基因分型，PCR 擴增反應體系為10 μl，內(nèi)含2×TaqMan Master Mix 5.0 μl，正、反向引物各0.45 μl，TaqMan FAM 探針、Taq Man HE×探針各0.25 μl，模板DNA 1.0 μl 及無酶水2.6 μl。GSTM3 rs7483 正向引物： 5'-CAAGATGCCCATCAACAACAA-3'，反向引物： 5'-GA AACAAAACAAGCTCTGCAAGTC-3'，長度21 bp；DPYD rs1801159 正向引物： 5'-TTGATCTGGTGGACATTAGT GTAGAAA-3'，反向引物： 5'-CTGGAGTTGCGCTAGC AAGA-3'，長度27 bp；UGT1A1 rs3755319，正向引物： 5'-CAATACTTGCCCCATAGTCCATG-3'，反向引物： 5'-TACTCATTCCACTGGCCCAAGAT-3'，長 度23 bp。反應條件為95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，共40 個循環(huán)。最后60℃延伸30 s。以未加DNA 模版的無酶水反應體系作為對照組。為驗證PCR 基因分型結(jié)果的準確性，隨機抽取部分樣品送南京驥驁生物技術有限公司進行測序。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件。3 個位點多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關系采用Logistic 回歸分析，以比值比（）和95%可信區(qū)間（95% CI）估計各研究因素與結(jié)直腸癌進展的關系，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR 基因分型結(jié)果

3 個位點的基因分型結(jié)果見圖1。由于UGT1A1 rs3755319 位點采用反向測序法，故AA 對應TT 基因型，AC 對應GT 基因型，CC 對應GG 基因型。測序結(jié)果與TaqMan-MGB 探針法的SNP 分型結(jié)果完全一致。

圖1 3 個位點PCR 基因分型圖與測序圖

2.2 GSTM3 基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關系

2.2.1 GSTM3 rs7483 多態(tài)性對結(jié)直腸癌臨床病理特征的影響隱性模型中GSTM3 rs7483 GG 基因型在Ⅰ、Ⅱ期的頻率高于Ⅲ、Ⅳ期[GG VS AA+GA：=0.466（95% CI： 0.261，0.834），P=0.010]。見表1。

2.2.2 分層分析GSTM3 rs7483 對結(jié)直腸癌臨床病理特征的影響對年齡進行分層，低齡患者（≤60 歲）GSTM3 rs7483 多態(tài)性與臨床病理特征無關；在高齡患者（＞60 歲）中，隱性模型中攜帶GG 基因型患者Ⅰ、Ⅱ期腫瘤比例是AA+GA 基因型的0.321 倍[GG VS AA+GA：=0.321（95% CI： 0.126，0.821），P=0.018]（見表2）。對性別進行分層，結(jié)果發(fā)現(xiàn)性別GSTM3 rs7483 與臨床病理特征無關（P＞0.05）（見表3）。

2.3 DPYD 基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關系

2.3.1 DPYD rs1801159 多態(tài)性對結(jié)直腸癌臨床病理特征的影響顯性模型中，AG+GG 基因型患者低分化腫瘤的比例是AA 基因型的1.398 倍[AG+GG VS AA：=1.398（95% CI： 1.004，1.946），P=0.047]。見表4。

2.3.2 分層分析DPYD rs1801159 對結(jié)直腸癌臨床病理特征的影響對年齡進行分層，≤60 歲人群中，與AA型比較，AG+GG 基因型患者低分化腫瘤的頻率高于中高分化[AG+GG VS AA：=1.775（95% CI： 1.132，2.785），P=0.012]，此外高齡患者中DPYD rs1801159基因型與結(jié)直腸癌臨床病理特征無關（P＞0.05）（見表5）。對性別進行分層，發(fā)現(xiàn)女性結(jié)直腸癌患者DPYD rs1801159 與腫瘤分化程度有關系，低分化組中AG+GG 基因型的頻率高于中高分化組[（AG+GG VS AA：=2.092（95% CI： 1.218，3.595），P=0.008]。此外，男性結(jié)直腸癌患者DPYD rs1801159 與臨床病理特征無關（P＞0.05）（見表6）。

表1 GSTM3 rs7483 與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關系

表2 年齡分層GSTM3 rs7483 與臨床病理特征的關系

2.4 UGT1A1 基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關系

在UGT1A1 rs3755319 多態(tài)性對結(jié)直腸癌臨床進展的影響中發(fā)現(xiàn)UGT1A1 rs3755319 與結(jié)直腸癌臨床病理特征無關（P＞0.05）。見表7。

表3 性別分層GSTM3 rs7483 與臨床病理參數(shù)的關系 例（%）

表4 DPYD rs1801159 與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關系

表5 年齡分層DPYD rs1801159 與臨床病理特征的關系

表6 性別分層DPYD rs1801159 與臨床病理特征的關系

表7 UGT1A1 rs3755319 與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關系

續(xù)表7

3 討論

結(jié)直腸癌作為全球發(fā)病率和致死率很高的惡性腫瘤之一，已經(jīng)成為危害人類健康的重大疾病[9]?；蚨鄳B(tài)性是人類基因組中最豐富的遺傳變異，其可能導致個體對環(huán)境應答、機體損傷反應性、各種疾病易感性以及疾病進展的差異[10]。代謝酶是生物體內(nèi)物質(zhì)代謝的重要組成部分，參與各種生命活動和過程。

目前關于UGT1A1 rs3755319 的研究報道極少，其與結(jié)直腸癌的關系尚不明確。SHIN 等[11]通過生物信息學分析和熒光素酶實驗，發(fā)現(xiàn)UGT1A1 rs3755319可能改變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，降低基因的表達。據(jù)報道，接受FOLFORI（5-氟尿嘧啶、亞葉酸鈣、伊立替康和奧沙利鉑）化療方案的晚期結(jié)直腸癌患者，UGT1A1 rs3755319 GG 比TT基因型發(fā)生3、4 級 中性粒細胞減少的毒性反應高9 倍，可能因為GG 基因型降低UGT1A1 酶活性，導致化療藥物代謝減少，體內(nèi)蓄積引起副作用[12]。本研究首次分析UGT1A1 rs3755319 與結(jié)直腸癌病理特征的關系，發(fā)現(xiàn)UGT1A1 rs3755319 與結(jié)直腸癌臨床病理特征無關。

目前關于GSTM3 rs7483 的研究較少，與結(jié)直腸癌的關系尚未闡明。MAES 等[13]研究GSTM3 與阿爾茨海默病的關系，發(fā)現(xiàn)GSTM3 rs7483 A 等位基因存在或者G 等位基因的缺失會降低GSTM3 mRNA 的表達水平。本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶GSTM3 rs7483 GG 基因型患者與Ⅰ、Ⅱ期結(jié)直腸癌有關，尤其與高齡患者Ⅰ、Ⅱ分期有關，提示腫瘤進展較慢。研究表明GST 可促進各種致癌物質(zhì)、治療藥物、環(huán)境毒素的解毒，因而可能延緩疾病進展，TAN 等[14]發(fā)現(xiàn)GSTM3 在腎細胞癌中具有抑制腫瘤的作用，rs1332018 基因變異使宿主下調(diào)腎臟中GSTM3 的表達，促進腫瘤發(fā)生，預測腎細胞癌術后不良預后。SHIOTA 等[15]研究表明，與AA 基因型比較，GG+AG 型與前列腺癌進展減慢相關。上述研究均表明GSTM3 發(fā)揮著延緩疾病進展的作用，本研究結(jié)論在一定程度上與上述結(jié)果一致。然而MEDING 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，GSTM3 在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者組織中高表達。本研究與該研究結(jié)論不一致，目前關于GSTM3 與結(jié)直腸癌進展相關的研究僅有MEDING 等報道，需要進行更多的探索。綜上研究，結(jié)合本研究結(jié)果，可能由于GSTM3 rs7483 GG 基因型使GSTM3 表達水平升高，在GSTM3 酶的作用下，各種致癌物和環(huán)境毒素被轉(zhuǎn)化成親水性代謝物排出體外，因而減少淋巴轉(zhuǎn)移，延緩結(jié)直腸癌的進展。本研究首次發(fā)現(xiàn)GSTM3 rs7483 GG 基因型患者多為Ⅰ、Ⅱ期結(jié)直腸癌，提示GG 基因型攜帶者疾病進展可能較慢。

研究顯示，DPYD 基因多態(tài)性影響DPD 的活性[17]。SHAUL 等[18]研究發(fā)現(xiàn)DPD 在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用，可能是腫瘤發(fā)生的機制之一。ZHANG等[6]研究發(fā)現(xiàn)DPYD rs1801159A＞G 降低DPD 活性，影響機體代謝化療藥物，導致化療藥物在體內(nèi)蓄積引起毒性反應。QIN 等[19]發(fā)現(xiàn)接受化療的乳腺癌患者中，DPYD rs1801159 AG 和GG 基因型患者的OS 和無疾病進展期比AA 基因型患者短。本研究發(fā)現(xiàn)攜帶AG和GG 基因型患者與低分化腫瘤有關，尤其與低齡和女性患者的低分化有關?？赡苁怯捎贏G 和GG 基因型降低DPD 酶活性，進而影響化療藥物代謝，毒物在體內(nèi)蓄積從而導致結(jié)直腸癌的惡化。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)攜帶GSTM3 rs7483 GG 基因型結(jié)直腸癌患者多為Ⅰ、Ⅱ分期，且BMI 低下，GG 基因型攜帶者在Ⅰ、Ⅱ期中的頻率高于Ⅲ、Ⅳ期，提示GG 基因型攜帶者疾病進展可能較慢。本研究還發(fā)現(xiàn)DPYD rs1801159 AG 和GG 基因型攜帶者呈現(xiàn)低分化，提示疾病進展可能較快，這為結(jié)直腸癌的早期預防提供依據(jù)。但由于不同種族基因型分布存在差異，部分候選SNPs 的具體分子作用機制有待深入研究，所得結(jié)論也有待更進一步的佐證。因此，在今后的研究中需要開展更大規(guī)模的人群流行病學調(diào)查，并綜合考慮基因與環(huán)境的協(xié)同作用，明確SNPs 的分子機制，為判斷或預測結(jié)直腸癌進展提供分子水平依據(jù)。