基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討雷公藤-雞血藤藥對治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機(jī)制

趙晶晶 鄭福增 馬俊福 馬夢洋 郭嘉

【摘 要】目的：探討雷公藤-雞血藤藥對治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。方法：使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）篩選雷公藤-雞血藤的活性成分，使用高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（GEO）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）、Genecards數(shù)據(jù)庫篩選與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的靶點(diǎn)，通過Cytoscape軟件繪制“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。利用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，利用R語言對靶點(diǎn)基因進(jìn)行基因本體（GO）、京都基因與基因組百科全書（KEGG）生物通路富集分析。結(jié)果：篩選出木犀草素、山柰酚、雷公藤甲素、甘草查爾酮A等70種活性成分，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3、絲裂原活化蛋白激酶1、絲裂原活化蛋白激酶14等120個核心靶點(diǎn)，共同靶點(diǎn)主要涉及核受體的活動、乙型肝炎、前列腺癌、腫瘤壞死因子信號通路等1566個生物過程和152條信號通路。結(jié)論：對雷公藤-雞血藤藥對治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，為進(jìn)一步闡述其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);雷公藤;雞血藤;藥對

【ABSTRACT】Objective：To explore the mechanism of the drug pair-Tripterygium Wilfordii and Caulis Spatholobi in the treatment of rheumatoid arthritis.Methods：TCMSP was used to screen the active components of Tripterygium Wilfordii and spatholobus Spatholobi.Databases GEO，OMIM and Genecards were used to screen the targets related to rheumatoid arthritis.The "compound target" network diagram was drawn by the software Cytoscape.The PPI network was constructed using the database String.The target genes were enriched in GO and KEGG by R language.Results：Seventy active components such as Luteolin，Kaempferol，Triptolide and Licochalcone A，and one hundred and twenty core targets，including signal transducer and activator of transcription 3，mitogen activated protein kinase 1 and mitogen activated protein kinase 14 were screened.The common targets mainly involved 1566 biological processes，such as nuclear receptor activity，hepatitis B，prostate cancer，tumor necrosis factor signaling pathway and 152 signal pathways.Conclusion：The mechanism of Tripterygium Wilfordii and Caulis Spatholobi in the treatment of rheumatoid arthritis was primarily discussed，which laid a foundation for further elaboration for its mechanism.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid;networkpharmacology;Tripterygium Wilfordii;Caulis Spatholobi;drug pair

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性炎癥性疾病，特點(diǎn)是滑膜組織增生，一般會引起骨和軟骨的破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和殘疾[1]。RA的病理改變是滑膜炎、血管翳形成并逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞[2]。現(xiàn)代研究表明，中醫(yī)藥治療RA能有效減少患者痛苦，提高預(yù)后生存質(zhì)量，改善西藥治療的依賴性，減少對身體的傷害，具有明顯的優(yōu)勢[3]。

雷公藤味苦、辛，性寒，有大毒，具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、消腫止痛等功效。研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤在器官移植排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病、腎病綜合征、癌癥等方面療效顯著[4]。一般認(rèn)為，其作用機(jī)制主要與抗炎和免疫抑制等相關(guān)，現(xiàn)代藥理研究表明，雷公藤多苷片能夠降低RA動物模型外周血及關(guān)節(jié)局部的促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平[5]。雞血藤具有活血補(bǔ)血、調(diào)經(jīng)止痛、舒筋活絡(luò)等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，雞血藤具有改善造血功能、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等作用[6]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，通過數(shù)據(jù)挖掘與分析，預(yù)測雷公藤-雞血藤治療RA的潛在作用靶點(diǎn)和信號通路，以期為RA的治療提供新的方向。

1 方法與材料

1.1 雷公藤-雞血藤有效成分及靶點(diǎn)的篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以口服生物利用度（OB）> 30%，藥物類藥性（DL）> 0.18為篩選條件[7]，獲得雷公藤-雞血藤有效成分及作用靶點(diǎn)，并通過人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Uniprot Database，https：//www.uniprot.org/）對各靶點(diǎn)人類基因簡稱進(jìn)行查詢。

1.2 RA作用靶點(diǎn)的篩選 在美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)平臺，選擇“GEO DateSets”，以“Rheumatoid Arthritis”為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)數(shù)據(jù)信息，種屬選擇人，獲取GSE93776原始文件和GPL570-55999的基因注釋文件，該數(shù)據(jù)包含83例RA患者和90例健康者信息。使用R語言（https：//www.r-project.org/）對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用多陣列平均分析（RMA）算法進(jìn)行背景校正和矩陣數(shù)據(jù)歸一化處理，利用Limma程序包分析芯片數(shù)據(jù)的差異基因，將顯著差異基因的篩選條件設(shè)定為P < 0.05，差異倍數(shù)（FC） > 2[8];運(yùn)用Plot程序包繪制數(shù)據(jù)的熱圖。最終獲得RA的差異基因。

以“Rheumatoid Arthritis”為關(guān)鍵詞，通過Genecards（https：//genealacart.genecards.org/）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，https：//www.omim.org/）獲得RA相關(guān)基因，將獲取的基因與獲取的差異基因取并集，獲取RA作用靶點(diǎn)。

1.3 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Strawberry Perl軟件（https：//www.perl.org/get.html）獲取雷公藤-雞血藤治療RA的潛在靶點(diǎn)。由Cytoscape軟件（https：//cytoscape.org/）繪制“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，其中用“節(jié)點(diǎn)（Node）”表示活性成分或靶點(diǎn)，用“邊（Edge）”表示活性成分與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系[9]。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將1.3中獲取的靶點(diǎn)上傳至PPI（String，https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，篩選條件為種屬選擇人，最小互作分?jǐn)?shù)值為0.7，其他參數(shù)保持默認(rèn)，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。將得到的結(jié)果輸入R語言，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶標(biāo)條圖。

1.5 GO和KEGG分析 利用R語言對1.3中獲取的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析，GO富集分析包括生物過程（biologica process）、分子功能（molecular function）和細(xì)胞成分（cellular component）3個模塊，設(shè)置閾值校正P < 0.05。由Cytoscape 對KEGG通路富集分析前20名的通路，構(gòu)建“通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié) 果

2.1 雷公藤-雞血藤有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果 在TCMSP中，符合篩選條件的有效成分70個（雷公藤51個、雞血藤22個，重復(fù)3個），對應(yīng)潛在靶點(diǎn)2227個（雷公藤1085個、雞血藤1142個，重復(fù)2032個）。在數(shù)據(jù)庫中找到對應(yīng)基因名的靶點(diǎn)173個。

2.2 RA的作用靶點(diǎn) 借助R語言分析，共篩選得到115個差異基因，其中上調(diào)基因數(shù)為49個，下調(diào)基因數(shù)為66個，并繪制熱圖，見圖1。通過GEO、OMIM、Genecards數(shù)據(jù)庫刪除重復(fù)值后得到4239個疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 “活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 利用perl軟件得到雷公藤-雞血藤治療RA的潛在基因120個，對應(yīng)活性成分45個。利用Cytoscape軟件構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)圖包括165個節(jié)點(diǎn)和461條邊。度值較高的活性成分為木犀草素、山柰酚、雷公藤甲素、甘草查爾酮A、川陳皮素、芒柄花黃素、植物甾醇等，具體見表1。與10個以上化合物存在關(guān)系的靶點(diǎn)有CHRM3、CHRM2、NOS2、PPARG、ESR1、PGR、AR、ADRB2、PTGS1、HSP90AA1、PTGS2。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 雷公藤-雞血藤治療RA的PPI網(wǎng)絡(luò)見圖3，將所得文件輸入R語言，篩選前20個核心靶標(biāo)繪制條圖，結(jié)果見圖4，鄰接點(diǎn)數(shù)目 > 20的基因有STAT3、MAPK1、MAPK14、AKT1、JUN、RELA、MAPK8，鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目越多，成為核心基因的概率越大。

2.5 富集分析 GO富集分析得到1566個條目，包括分子功能相關(guān)條目135個、生物過程相關(guān)條目1380個、細(xì)胞成分相關(guān)條目51個，根據(jù)校正過的P值排序，分子功能主要涉及核受體的活動、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等;生物過程富集主要涉及對脂多糖反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、對金屬離子的響應(yīng)、對抗生素反應(yīng)、對類固醇激素反應(yīng)等;細(xì)胞成分主要涉及膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)域、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)雜、囊腔等。

KEGG富集分析得到144個條目，根據(jù)校正過的P值篩選出前20條繪制表格，如表2所示，主要涉及乙型肝炎、前列腺癌、腫瘤壞死因子信號通路、白細(xì)胞介素-17（IL-17）信號通路、Th17細(xì)胞分化、Toll樣受體信號通路等。將前20條KEGG通路及其相關(guān)的73個靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件，得到“通路-靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，見圖5，共有93個節(jié)點(diǎn)（20個KEGG通路和73個基因節(jié)點(diǎn)）和428條邊，涉及12條通路以上的基因?yàn)镴UN、NFKBIA、MAPK8、IKBKB、RELA、AKT1。

3 討 論

雷公藤對免疫性疾病有確切的療效，但有毒副作用，配以雞血藤可以降低毒性，增強(qiáng)治療作用[10]。

為了減少雷公藤對RA患者生殖系統(tǒng)所造成的影響，高立珍等[11]采用雷公藤6～10 g，配用雞血藤30 g以改善月經(jīng)量少或者閉經(jīng)的癥狀，雞血藤具有調(diào)經(jīng)作用（雷公藤能使白細(xì)胞減少，而雞血藤恰能升高白細(xì)胞）。雷公藤苦寒清熱力強(qiáng)，消腫止痛效著，尤宜于關(guān)節(jié)晨僵、腫脹難消、紅腫熱痛、活動受限，甚至關(guān)節(jié)畸形，為治風(fēng)濕頑痹之要藥。雞血藤苦甘而溫，行血養(yǎng)血、舒經(jīng)活絡(luò)。丁鍔[12]常用雷公藤配雞血藤，以養(yǎng)血祛風(fēng)通絡(luò)、活血蠲痹止痛，臨證收效良好。

本研究篩選得到雷公藤-雞血藤70個有效成分，45個成分具有潛在治療RA的作用;作用靶點(diǎn)較多的5個活性成分為木犀草素（47個）、山柰酚（37個）、雷公藤甲素（32個）、甘草查爾酮A（23個）、川陳皮素（22個）;木犀草素具有抑制免疫、抗炎的作用[13]。山柰酚是一種黃酮類化合物，既往研究表明，其具有抗癌、抗炎、抗氧化等多種藥理學(xué)作用;且有研究證實(shí)，山柰酚能有效緩解膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀，抑制滑膜炎癥、關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)破壞[14]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，雷公藤甲素能夠明顯改善Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹情況，作用機(jī)制與促進(jìn)IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β表達(dá)，增加Treg細(xì)胞比例，抑制IL-17、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血管內(nèi)皮生長因子、γ干擾素表達(dá)有關(guān)，并且短期內(nèi)無明顯肝毒性[15]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，川陳皮素可以抑制小鼠巨噬細(xì)胞中IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白及mRNA的表達(dá)，從而發(fā)揮其抗炎作用[16]。

雷公藤-雞血藤治療RA的核心基因有STAT3、MAPK14、AKT1、JUN、RELA、HSP90AA1、MAPK8、CDKN1A等。研究表明，STAT3為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子，在RA滑膜成纖維樣細(xì)胞增殖及炎癥反應(yīng)中均有影響[17]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在RA滑膜組織中，炎性因子等因素刺激使MAPK14異?；罨种芓NF受體超家族成員6誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，使組織中的炎癥持續(xù)存在[18]。通過敲減AKT的表達(dá)，可能對RA出現(xiàn)的滑膜組織異常增殖、侵襲關(guān)節(jié)組織等病理特征起到一定的抑制作用[19]。目前研究已經(jīng)證實(shí)，RA不僅顯示出病理癥狀的晝夜節(jié)律性，而且核受體及其調(diào)控的代謝通路紊亂也參與RA的病理過程。

雷公藤-雞血藤治療RA的潛在基因的KEGG通路眾多，主要涉及乙型肝炎、前列腺癌、TNF信號通路、人類巨細(xì)胞病毒感染、IL-17信號通路等。許多研究表明，感染可能是RA發(fā)病機(jī)制之一[20]。

有研究表明，乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白可以通過誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）的轉(zhuǎn)錄、翻譯和分泌來促進(jìn)細(xì)胞遷移。在這種情況下，慢性乙型肝炎狀態(tài)可能通過上調(diào)MMP-3而部分影響RA患者的影像學(xué)和臨床結(jié)局[21]。此外，一項基于1999年至2009年的數(shù)據(jù)研究顯示，與非RA隊列相比，RA患者中HBV感染的患病率和風(fēng)險更高[22]。臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用甲氨蝶呤治療RA引起的免疫功能障礙導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制，最終致使前列腺癌的快速進(jìn)展和廣泛的骨轉(zhuǎn)移[23]。TNF作為一種關(guān)鍵的細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)廣泛的細(xì)胞內(nèi)信號通路，包括細(xì)胞凋亡、炎癥和免疫。其在RA患者的關(guān)節(jié)滑液和滑膜組織中的表達(dá)明顯上升，并且可影響滑膜中各種細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)微環(huán)境的改變，進(jìn)一步加重關(guān)節(jié)破壞[24]。有研究顯示，IL-17可明顯促進(jìn)RA患者成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖，且IL-17刺激的滑膜成纖維樣細(xì)胞分泌中性粒細(xì)胞激活肽-78、IL-8、生長相關(guān)癌基因、單核細(xì)胞趨化蛋白-1明顯增加[25]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對雷公藤-雞血藤治療RA的機(jī)制進(jìn)行初步分析，為深入研究提供新思路。但是僅通過潛在的基因靶點(diǎn)、信號通路研究存在一定的局限性，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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收稿日期：2020-04-16;修回日期：2020-05-28