特應(yīng)性皮炎患者面部、上肢和背部皮損真菌群落多樣性分析

陸茂 冉玉平 代亞玲 歐美 吳紅梅 羅媛元

1四川大學(xué)華西醫(yī)院皮膚科，成都610041；2成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚科610500陸茂現(xiàn)在成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚科，成都610500

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種臨床常見的慢性、復(fù)發(fā)性、瘙癢性、炎癥性皮膚病。近年來微生物定植（包括細(xì)菌、真菌等）在AD 發(fā)病中的作用逐漸得到重視，但既往對微生物的研究僅集中在其中少數(shù)幾種，多采用分離培養(yǎng)法來確定微生物與AD 的關(guān)系，未從宏觀上兼顧微生物協(xié)作共生的角度分析，缺乏對微生物群落整體分布和結(jié)構(gòu)的研究。目前對AD患者皮膚微生物多樣性研究主要集中于細(xì)菌群落［1?3］，而對皮膚真菌群落多樣性研究的報道很少。我們在AD 患者面部、上肢和背部皮損區(qū)和健康人相應(yīng)區(qū)域采樣，提取樣品DNA，應(yīng)用真菌通用引物內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）1 和ITS2 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，通過MiSeq 高通量測序及生物信息學(xué)研究，分析AD 患者皮膚真菌群落多樣性及其與臨床特征的相關(guān)性。

對象與方法

一、對象

10 例入選的AD 患者來自2015 年9- 10 月成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚科門診，符合AD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］，且每例患者皮損均累及面部、上肢和背部。男5 例，女5 例；年齡2～12（7.30 ± 3.89）歲。10例健康對照來自成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院工作人員子女，男6例，女4例；年齡3～14（6.90±3.54）歲。受試者2周內(nèi)無使用抗真菌藥物和糖皮質(zhì)激素史，采樣前24 h內(nèi)不能在采樣部位使用任何清潔用品（包括水洗）或藥物，不伴有其他皮膚病，不伴有腫瘤或其他嚴(yán)重疾患。對AD 患者病情嚴(yán)重程度進(jìn)行評分，參照濕疹面積及嚴(yán)重度指數(shù)（eczema area and severity index，EASI）評分法［5］，<7 分為輕度，7～21 分為中度，> 21 分為重度［6］，10 例AD 患者EASI評分為（16.51±14.71）分（范圍3.0～55.2 分），其中輕度3 例，中度4 例，重度3例。本研究通過成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批件號2018CYFYHEC?BA?40），所有受試者的監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書，對有能力做出同意參加臨床試驗(yàn)決定的兒童，還征得其本人同意。

二、方法

1.主要試劑和儀器：醫(yī)用無菌棉簽（成都市新津事豐醫(yī)療器械有限公司），E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（美國Omega Bio?Tek 公司），ITS1、ITS2 引物（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司），ABI GeneAmp?9700型PCR 儀（美國Thermo 公司），QuantiFluor??ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（美國Promega 公司），F(xiàn)R?200A 凝膠成像系統(tǒng)（上海復(fù)日科技有限公司），Nanodrop 3300熒光分光光度計（美國Thermo公司），Miseq測序儀（美國Illumina公司）。

2.采樣：采樣部位為AD患者面部、上肢和背部皮損區(qū)以及健康對照的相應(yīng)區(qū)域，AD 患者皮損區(qū)為慢性或消退期無滲出皮損。采樣時室溫26 ℃左右。采樣方法：在采樣部位選取一處約3 cm×3 cm區(qū)域；將醫(yī)用無菌棉簽在生理氯化鈉溶液中潤濕，在選定區(qū)域內(nèi)來回涂擦50 次，持續(xù)時間約45 s；用無菌鑷子取下棉簽頭并放置在1.5 ml 無菌EP 管中，-80 ℃保存。健康對照樣本按面部、上肢、背部順序依次編為1～30 號，AD 患者依次編為31～60號。

3.樣本DNA 的提取、PCR 擴(kuò)增及MiSeq 測序：所有樣本送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 提取皮膚樣本DNA。利用ITS1引物（5′?CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA?3′）、ITS2引物（5′?GCTGCGTTCTTCATCGATGC?3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20 μl，包括10 × 緩沖液2 μl、2.5 mmol/L dNTPs 2 μl、5 μmol/L 上游和下游引物各0.8 μl、rTaq聚合酶0.2 μl、DNA模板2 μl，牛血清白蛋白0.2 μl，補(bǔ)ddH2O 至20 μl。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。利用Illumina MiSeq 技術(shù)測序平臺，完成擴(kuò)增子測序。

4.生物信息分析：對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到優(yōu)化序列。然后在去除嵌合體序列后進(jìn)行序列可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）的劃分聚類分析，并對OTU 的代表序列作分類學(xué)分析?；贠TU 聚類分析結(jié)果進(jìn)行多樣性指數(shù)分析、主成分分析，基于OTU 分類學(xué)信息結(jié)果進(jìn)行物種組成分析。采用Shannon 指數(shù)計算微生物群落多樣性，其數(shù)值越大說明群落多樣性越高。

5.統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，兩兩組間多重比較采用LSD?t 檢驗(yàn)，P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、測序結(jié)果

原始測序數(shù)據(jù)為1 773 637×2條reads，經(jīng)質(zhì)控過濾后得到2 652 101 條優(yōu)化（有效）序列，平均長度242.77 bp。所有序列經(jīng)過聚類，60 個樣本共得到4 312 個有效OTU。其中10 例AD 患者的30 份標(biāo)本有3 357個有效OTU，10例健康對照的30份標(biāo)本有2 956個有效OTU，兩者共有2 001個相同的有效OTU。

二、多樣性指數(shù)分析

AD 患者組總樣本和面部、上肢、背部樣本Shannon 指數(shù)均高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05 或0.01），見表1。AD 患者組3 個部位Shannon 指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.51，P > 0.05），健康對照組差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（F =0.42，P>0.05）。

三、物種組成分析

1.總樣本真菌群落結(jié)構(gòu)分析：所有樣本中超過99%的真菌來自擔(dān)子菌門（58.50%）和子囊菌門（40.92%）。其中擔(dān)子菌門的馬拉色菌屬在各樣本中均占主要地位，在AD 患者組總樣本中豐度為42.59%，健康對照組為49.34%，兩組高于0.1%的屬均為88 個，除馬拉色菌屬外其他屬的豐度都<10%，豐度>1%的主要真菌屬見表2。AD患者組念珠菌屬、曲霉屬豐度高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t 值分別為3.515、2.137，均P<0.05），其余各主要真菌屬豐度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2. 不同部位真菌屬構(gòu)成分析：見圖1，兩組馬拉色菌屬均占主要地位（豐度近50%）。AD 患者組、健康對照組面部皮膚豐度高于0.1%的屬分別有87 個、82 個，上肢均為86 個，背部分別為85 個、86 個，豐度> 1%的主要真菌屬見表3。兩組面部各主要真菌屬（豐度>1%）豐度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）；AD患者組上肢念珠菌屬豐度高于健康對照組（t=3.186，P<0.05），其余各主要真菌屬豐度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。AD 患者組背部曲霉屬豐度高于健康對照組（t = 2.736，P<0.05），其余各主要真菌屬豐度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。兩組面部、上肢和背部樣本之間主要真菌屬（豐度>1%）豐度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表1 特應(yīng)性皮炎患者組與健康對照組皮膚樣本真菌Shannon指數(shù)比較（±s）

表1 特應(yīng)性皮炎患者組與健康對照組皮膚樣本真菌Shannon指數(shù)比較（±s）

組別患者組健康對照組t值P值例數(shù)10 10總樣本4.04±2.80 3.21±0.99 4.45<0.01面部4.11±0.28 3.42±0.77 2.67 0.02上肢3.98±0.34 3.04±1.14 2.37 0.04背部4.05±0.19 3.14±0.84 3.34 0.01

表2 特應(yīng)性皮炎患者組和健康對照組皮膚樣本總樣本豐度>1%的真菌屬

3.AD 患者樣本真菌屬構(gòu)成分析：輕、中、重度AD 患者組均以馬拉色菌屬占主要地位（近50%），見圖2。輕、中、重度AD患者組豐度高于0.1%的屬分別有81、82 和84 個，豐度>1%的主要真菌屬見表4。輕、中、重度AD患者組各主要真菌屬豐度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。

圖1 特應(yīng)性皮炎（AD）患者和健康對照面部、上肢和背部皮膚樣本真菌群落結(jié)構(gòu)柱形圖

圖2 輕中重度特應(yīng)性皮炎（AD）患者皮膚樣本真菌群落結(jié)構(gòu)柱形圖

4.馬拉色菌屬結(jié)構(gòu)分析：AD患者組共有（5.37±1.94）個馬拉色菌菌種，健康對照組（4.10±1.42）個，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.885，P<0.05）。

AD患者組與健康對照組馬拉色菌菌種構(gòu)成見表5，球形馬拉色菌、限制馬拉色菌豐度較高，兩者合計約為80%。球形馬拉色菌在AD患者組樣本中占41.19% ± 34.17%，在健康對照組中占35.70% ±29.42%，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t = 0.828，P >0.05）；限制馬拉色菌在AD 患者組占40.07% ±28.71%，在健康對照組占42.07%±36.54%，兩組差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.409，P>0.05）；其余各馬拉色菌菌種在兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P >0.05）。

表3 特應(yīng)性皮炎（AD）患者和健康對照面部、上肢和背部皮膚樣本主要真菌屬（豐度>1%）

5.念珠菌屬結(jié)構(gòu)分析：AD 患者組共有（5.77±3.01）個念珠菌菌種，健康對照組有（4.90 ± 2.09）個，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t = 1.294，P > 0.05）。兩組念珠菌菌種構(gòu)成見表6，近平滑念珠菌豐度較高，占比均>75%。各念珠菌菌種在兩組間的比例差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表4 輕中重度特應(yīng)性皮炎患者皮膚樣本主要真菌屬（豐度>1%）

表5 特應(yīng)性皮炎患者與健康對照皮膚馬拉色菌菌種構(gòu)成

四、AD 患者組各部位皮膚真菌群落主成分分析

見圖3，AD患者組面部、上肢、背部皮膚真菌群落未按病情嚴(yán)重程度聚類。

討 論

早期的皮膚微生物多樣性研究主要采用分離培養(yǎng)來識別微生物群落的結(jié)構(gòu)特征，而大量微生物因生長條件苛刻不能或不易分離培養(yǎng)［7］，因此難以全面認(rèn)識皮膚微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，在皮膚原位取樣進(jìn)行高通量測序，在分子水平基于序列分析成為研究皮膚微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)特征的主流方法［8］。不少研究者使用此方法研究皮膚細(xì)菌的群落特征，但針對皮膚真菌的研究則很少。2013年，美國學(xué)者［9］首次報道用高通量測序技術(shù)研究健康人皮膚真菌群落多樣性的方法和結(jié)果，即使用棉簽收集10例18～40歲健康人14個部位的皮膚樣本，利用ABI3730xl和羅氏454 測序平臺，對樣本中的ITS1 區(qū)進(jìn)行測序分析。結(jié)果顯示，樣本中真菌均來自擔(dān)子菌門和子囊菌門，擔(dān)子菌門的馬拉色菌屬在除足部的其他11個部位占主要地位，其真菌群落多樣性主要表現(xiàn)在馬拉色菌各個菌種的分布，其中外耳道、耳后和眉間以限制馬拉色菌為主，中上背、枕部和腹股溝以球形馬拉色菌為主，鼻孔、肘窩、前臂屈側(cè)和小魚際以球形馬拉色菌、限制馬拉色菌和合軸馬拉色菌為主，而足部的3個部位真菌群落多樣性非常高，約有80種真菌。Zhang 等［10］采用高通量測序技術(shù)研究9 例AD 患者面部皮損和10 例健康對照相同區(qū)域的真菌群落多樣性，結(jié)果顯示：①AD患者組中馬拉色菌屬占主要地位（68.7%），非馬拉色菌酵母菌占19.9%，霉菌占12.3%，健康對照組中馬拉色菌屬也占主要地位（79.2%），非馬拉色菌酵母菌占12.8%，霉菌占8.1%；②球形馬拉色菌和限制馬拉色菌是AD 患者組和健康對照組的主要菌種；③共檢測到15個非馬拉色菌酵母菌屬，排在前3位的是念珠菌屬、枝孢屬和隱球菌屬，AD患者非馬拉色菌酵母菌菌種多樣性顯著高于健康對照；④共檢測到16 個霉菌屬，排在前3 位的是鏈格孢屬、Apioplagiostoma和曲霉屬，AD 患者霉菌菌種多樣性與健康對照無顯著差異。

表6 特應(yīng)性皮炎患者與健康對照皮膚樣本念珠菌菌種構(gòu)成

圖3 輕中重度特應(yīng)性皮炎患者皮膚樣本真菌群落主成分分析圖 3A：面部；3B：上肢；3C：背部

本研究中AD患者組和健康對照組各部位皮膚真菌物種分布以擔(dān)子菌門的馬拉色菌占主要地位，總體豐度約占50%，而美國健康人皮膚真菌多樣性研究結(jié)果顯示，相同部位馬拉色菌的相對豐度接近100%［9］，日本研究結(jié)果顯示，AD患者面部皮損馬拉色菌的相對豐度為68.7%，健康對照為79.2%［10］。國內(nèi)報道顯示，健康青年女性面部馬拉色菌的相對豐度為48.2%［11］，這提示人種和地區(qū)可能是影響皮膚馬拉色菌定植的兩個重要因素。除馬拉色菌屬外，AD 患者和健康對照面部、上肢、背部豐度相對較高的主要真菌屬還有念珠菌屬、曲霉屬、隱球菌屬、枝孢屬、毛孢子菌屬、鏈格孢屬、鐮刀菌屬等，與國內(nèi)外研究結(jié)果類似［9?11］。本研究主成分分析顯示，AD 患者面部、上肢、背部皮損真菌群落未按病情嚴(yán)重程度聚類，提示其真菌群落組成與疾病嚴(yán)重程度無相關(guān)性。微生物導(dǎo)致AD發(fā)病多是作為變應(yīng)原進(jìn)入體內(nèi)引起相關(guān)免疫反應(yīng)所致，其病情嚴(yán)重程度與進(jìn)入體內(nèi)引起免疫反應(yīng)微生物的種類和數(shù)量有關(guān)，由于AD患者多有皮膚屏障功能障礙［12］，可影響微生物進(jìn)入體內(nèi)難易程度，而且皮損的性質(zhì)、局部免疫反應(yīng)也可能對微生物入侵有影響，推測患者的病情嚴(yán)重程度不僅與皮膚表面微生物的定植情況有關(guān)，還可能受多種與微生物入侵相關(guān)因素的影響，因此從理論上來說AD 患者皮膚表面真菌群落分布不一定與疾病嚴(yán)重程度有相關(guān)性。不過考慮到本研究病例數(shù)太少，上述結(jié)論仍需進(jìn)行更多病例的驗(yàn)證。

本研究多樣性指數(shù)分析顯示，AD患者面部、上肢、背部皮損區(qū)真菌群落多樣性明顯高于健康對照相應(yīng)區(qū)域。皮膚與其表面定居的大量微生物構(gòu)成皮膚微生態(tài)系統(tǒng)，微生物與微生物之間、微生物與宿主之間緊密聯(lián)系、相互影響，皮膚生理狀態(tài)的改變可引起微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化，推測AD患者真菌群落多樣性高于健康對照可能的原因包括：①AD 患者皮膚生理狀態(tài)的異常主要表現(xiàn)為屏障功能障礙，包括角質(zhì)層含水量、皮膚表面pH值、皮脂含量等異常［13?15］，既往研究表明這些指標(biāo)的異常與真菌的異常定植或感染有關(guān)［16?18］；②AD患者皮膚聚絲蛋白（FLG）、兜甲蛋白（LOR）、內(nèi)披蛋白（IVL）等角化包膜成分表達(dá)減少甚至缺乏［19?20］，而FLG、LOR和IVL表達(dá)下降與真菌感染有關(guān)［21］；③AD患者皮膚抗菌肽表達(dá)下降，也有利于真菌的定植和感染［22］；④AD 患者普遍存在Th1/Th2細(xì)胞因子失衡，白細(xì)胞介素（IL）?4、IL?6、IL?13等水平明顯升高［23］，IL?4、IL?13 可抑制AD 患者皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞FLG、LOR、IVL 及人β 防御素2 的表達(dá)［24?27］，IL?4、IL?6 可下調(diào)AD 患者角質(zhì)層細(xì)胞神經(jīng)酰胺的表達(dá)［28］，而神經(jīng)酰胺、人β 防御素2 參與皮膚的固有免疫，防御真菌等病原體的入侵［29?30］。總之，皮膚物理屏障功能障礙、皮膚表面抗菌肽表達(dá)異常、Th1/Th2 細(xì)胞因子失衡均有利于真菌的定植和感染，可能是導(dǎo)致AD 患者面部、上肢、背部皮損區(qū)真菌群落多樣性明顯高于健康對照相應(yīng)區(qū)域的原因。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突