注射氨基酮戊酸光動力療法對大鼠痤瘡樣炎性結(jié)節(jié)模型的療效及組織病理學影響

趙菊花 莊化迪 劉順英 曾潤鑫 宋錦渲

1南充市中心醫(yī)院皮膚科 川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院，四川637000；2西南醫(yī)科大學研究生院，四川瀘州646000；3川北醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，四川南充637000

中重度痤瘡的皮疹以結(jié)節(jié)、囊腫為主，屬難治性痤瘡類型，嚴重者可留有凹陷性或者增生性瘢痕。光動力療法（photodynamic therapy，PDT）治療中重度痤瘡效果良好，目前臨床上常規(guī)方法是外敷鹽酸氨基酮戊酸（ALA）溶液后照光，但結(jié)節(jié)、囊腫等病灶可能因囊腫壁較厚、吸收光敏劑較少致療效欠佳［1］。國外學者［2］將ALA 局部注射到痤瘡患者皮損內(nèi)進行光動力治療，發(fā)現(xiàn)早期改善效果較好，可以減少總治療次數(shù)，且不良反應(yīng)少。目前國內(nèi)ALA只有外用劑型，直接注射ALA 入痤瘡皮損內(nèi)的有效性和安全性未見報道。我們配制5%ALA 溶液皮下注射入大鼠耳廓痤瘡樣炎癥結(jié)節(jié)模型后采用PDT治療，觀察大鼠耳廓的組織病理改變。

一、材料與方法

1.實驗動物：40只SPF級、6 ～8周齡、體重（180±20）g健康SD 大鼠，雌雄各半。由川北醫(yī)學院動物中心提供動物、清潔級動物飼養(yǎng)房（溫度25 ℃，濕度50%～60%）和SPF級動物實驗室。實驗動物合格證號為SCXK（川）2018?18，實驗動物使用許可證號為SYXK（川）2018?076。

2.主要試劑及儀器：ALA（上海復旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司）保存于4 ℃冰箱，實驗當天在避光條件下于118 mg ALA 加入2 ml 滅菌注射用水配成5%ALA 溶液備用。LED?1B 型紅光治療儀［波長（633±10）nm，武漢亞格光電技術(shù)股份有限公司］、痤瘡丙酸桿菌標準株（ATCC6919，廣東微生物研究所）。

3.大鼠分組與造模：將大鼠按體重編號，按照隨機數(shù)字表將40只大鼠分為正常對照組（10只）、造模組（30只）。將保存于-80 ℃冰箱的痤瘡丙酸桿菌標準株在室溫下復溫，接種于布魯氏瓊脂平板，放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋，置于37 ℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，采用麥氏比濁法計數(shù)，用滅菌注射用水調(diào)至濃度3×108菌落形成單位/ml，參照文獻［3］和預實驗結(jié)果，在造模組每只大鼠右側(cè)內(nèi)耳廓中央皮內(nèi)注射痤瘡丙酸桿菌液100 μl，隔天同一部位注射1 次，共3 次，最后1 次菌液注射后第7 天肉眼觀察并觸摸到大鼠耳部均有結(jié)節(jié)，隨機抽取1只大鼠，用無菌針頭挑取鼠耳廓腫脹部位，接種于布魯氏瓊脂培養(yǎng)皿，厭氧罐中培養(yǎng)48 h，證明為痤瘡丙酸桿菌，表明建成大鼠耳痤瘡樣炎性結(jié)節(jié)模型。造模成功后按照隨機數(shù)字表法將造模組分為3 組，即模型對照組、外敷ALA組、注射ALA組，每組10只。

4. 治療方案：正常對照組大鼠正常飼養(yǎng)，不做任何治療。模型對照組造模成功后繼續(xù)飼養(yǎng)，不予后續(xù)治療。外敷ALA 組采用50 μl 5%ALA 浸濕紗布外敷在皮損處，塑料薄膜封包，避光2 h后照紅光。注射ALA組在耳廓結(jié)節(jié)處皮下多點注射50 μl 5%ALA溶液，避光2 h后照紅光。照光距離10 cm，能量密度80 mW/cm2，波長633 nm，時間10 min。每周治療1 次，共2 次。末次治療24 h 后麻醉大鼠，取心臟血，并剪取鼠耳組織檢測相關(guān)指標。

5.療效觀察：末次治療24 h 后肉眼觀察各組大鼠耳廓紅腫、結(jié)節(jié)大小、皮損表面情況等。于大鼠右耳耳廓同一部位測量各組大鼠耳廓厚度。

6. 組織病理檢查：剪取鼠耳組織以4%甲醛固定24 h后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，觀察各組組織病理變化。

7.安全性指標檢測：取各組大鼠心臟血，檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酐（Cre）、尿素氮（BUN）。

8. 統(tǒng)計學方法：采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較采用LSD?t 檢驗。以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

二、結(jié)果

1.大鼠耳廓厚度比較：實驗結(jié)束時，正常對照組、模型對照組、外敷ALA 組、注射ALA 組大鼠耳廓厚度分別為（0.435±0.006）、（1.269±0.071）、（1.088±0.098）、（0.699±0.095）mm，差異有統(tǒng)計學意義（F = 235.60，P < 0.001），模型對照組高于正常對照組、外敷ALA 組和注射ALA 組（t值分別為24.18、5.24、16.48，均P<0.01）；注射ALA 組低于外敷ALA組（t=11.24，P<0.01）。

2.大鼠耳部皮膚大體觀察（圖1）：實驗結(jié)束時，正常對照組大鼠右耳廓皮膚無變化；模型對照組自造模完成后，注射局部皮膚持續(xù)紅腫，至實驗結(jié)束時該紅腫仍持續(xù)存在，并在該部位可觸摸到明顯的結(jié)節(jié)，質(zhì)較硬；外敷ALA組局部仍有輕度的紅腫，5只大鼠右側(cè)耳廓仍可觸摸到結(jié)節(jié)，但紅腫和結(jié)節(jié)較模型組軟和??；注射ALA 組3 只大鼠右側(cè)耳廓在第1 次注射ALA 的第2 天可見結(jié)痂，經(jīng)外用聚維酮碘處理后，3 ～4 d脫落，實驗結(jié)束時7只大鼠右側(cè)耳廓紅腫消退，未觸摸到明顯的結(jié)節(jié)，皮膚表面正常，但3只大鼠右側(cè)耳廓皮膚表面于治療處可見輕度瘢痕形成。

3.大鼠耳廓皮膚組織病理（圖2）：實驗結(jié)束時，正常對照組大鼠耳廓表皮、真皮、皮脂腺、軟骨、肌肉均未見明顯病變。模型對照組表皮大致正常，真皮深層及皮下組織結(jié)構(gòu)消失，其內(nèi)可見大量炎癥細胞彌漫性浸潤，8只形成膿腫和炎癥細胞聚集成結(jié)節(jié)狀，3只耳軟骨結(jié)構(gòu)被局限性破壞，皮脂腺數(shù)量較少、體積較小。外敷ALA組表皮大致正常，毛囊皮脂腺縮小，真皮及皮下組織可見炎癥細胞浸潤，5只形成小的微膿腫。注射ALA 組大鼠耳廓表皮正常，真皮及皮下組織內(nèi)浸潤的炎癥細胞較模型組和外敷ALA 組明顯減少，可見較多的膠原纖維和血管擴張、充血。

4. 大鼠肝腎功能比較：實驗結(jié)束時，各組大鼠ALT、AST、Cre、BUN差異均無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。見表1。

三、討論

中重度痤瘡既往多采用維A酸制劑聯(lián)合局部外用或系統(tǒng)口服抗生素治療，但因不良反應(yīng)多，臨床應(yīng)用受到限制［4］。目前外敷ALA?PDT是治療中重度痤瘡行之有效的方法之一［5］。但以結(jié)節(jié)、囊腫為主要表現(xiàn)的中重度痤瘡，皮損浸潤較深，還常伴嚴重增厚的囊壁，故常規(guī)直接外敷光敏劑ALA 很難被吸收，使PDT 療效不佳［1］。有學者曾用粉刺針清［4］、火針、激光［6］、微針等預處理皮損后形成孔道以增加ALA吸收。有學者［2］將ALA局部注射到痤瘡患者皮損內(nèi)再行PDT，但大多是一些小樣本的研究，且其療效不一。

本研究參照文獻［7］，以大鼠作為模型動物，經(jīng)痤瘡丙酸桿菌皮內(nèi)注射大鼠耳廓內(nèi)側(cè)面造模后，出現(xiàn)了耳廓紅斑、腫脹、結(jié)節(jié)等表現(xiàn)，且皮損培養(yǎng)證明是痤瘡丙酸桿菌感染。造模后模型組大鼠耳廓紅腫，可觸及結(jié)節(jié)，且其耳廓厚度明顯大于正常對照組，證明成功制備大鼠耳廓痤瘡樣炎性結(jié)節(jié)模型。實驗結(jié)果顯示，外敷ALA組和注射ALA組與模型對照組比較，大鼠耳廓的腫脹程度和耳廓厚度均顯著降低，提示外敷或注射ALA?PDT 均能抑制痤瘡丙酸桿菌導致的大鼠耳廓腫脹。與外敷ALA組比較，注射ALA組大鼠耳廓厚度減少更明顯，提示注射ALA 到皮損內(nèi)再照光的光動力治療較直接外敷ALA治療更有效。各組大鼠耳廓外觀和組織病理切片觀察結(jié)果顯示，在實驗結(jié)束時，模型對照組局部紅腫，仍可觸摸到明顯的結(jié)節(jié)，質(zhì)較硬；表皮大致正常，真皮深層及皮下組織結(jié)構(gòu)消失，其內(nèi)可見大量炎癥細胞彌漫性浸潤，部分形成膿腫，炎癥細胞聚集成結(jié)節(jié)狀，皮脂腺數(shù)量較正常對照組少且體積較小。外敷ALA組局部仍有輕度的紅腫，部分大鼠右側(cè)耳廓仍可觸摸到結(jié)節(jié)，但紅腫較模型組輕，結(jié)節(jié)較模型組??；表皮大致正常，毛囊皮脂腺縮小，真皮及皮下組織可見較多炎癥細胞浸潤，部分形成小的微膿腫，但炎癥細胞數(shù)量較模型對照組少。注射ALA組7只大鼠耳廓紅腫消退，未觸摸到明顯的結(jié)節(jié)，皮膚表面正常；耳廓表皮正常，真皮及皮下組織內(nèi)浸潤的炎癥細胞較模型組和外敷ALA 組明顯減少，未見團塊狀分布的炎癥細胞或者微膿腫形成，可見較多的膠原纖維和擴張的血管、充血。上述大體和組織病理學檢查結(jié)果提示，注射ALA?PDT 可治療大鼠痤瘡樣炎性結(jié)節(jié)模型的結(jié)節(jié)，明顯減輕痤瘡丙酸桿菌引起的炎癥反應(yīng)，且較外敷ALA?PDT的療效更好。

表1 氨基酮戊酸（ALA）光動力療法對大鼠肝腎功能的影響（±s）

表1 氨基酮戊酸（ALA）光動力療法對大鼠肝腎功能的影響（±s）

注：n=10

組別正常對照組模型對照組外敷ALA組注射ALA組F值P值天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（U/L）105.2±17.5 109.5±20.5 102.7±18.1 100.2±18.3 0.45 0.71丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（U/L）28.8±5.0 31.2±7.6 30.3±7.8 31.1±6.8 0.25 0.85尿素氮（μmol/L）32.0±6.5 34.0±7.8 32.3±7.1 30.3±7.3 0.43 0.73肌酐（μmol/L）5.9±0.6 6.3±0.7 6.2±0.7 6.4±0.9 1.02 0.39

圖1 氨基酮戊酸（ALA）光動力療法治療后各組大鼠耳廓皮膚大體觀 1A：正常對照組皮膚無變化；1B：模型對照組皮膚紅腫，可觸及結(jié)節(jié)；1C：外敷ALA組可見輕度紅腫，仍可觸及結(jié)節(jié)；1D：注射ALA治療組紅腫和結(jié)節(jié)基本消退

圖2 氨基酮戊酸（ALA）光動力療法治療后各組大鼠耳部皮膚組織病理變化（HE×100） 2A：正常對照組表皮真皮結(jié)構(gòu)正常；2B：模型對照組真皮內(nèi)大量炎癥細胞浸潤，形成團塊狀結(jié)節(jié)；2C：外敷ALA組真皮內(nèi)仍有較多炎癥細胞浸潤、微膿腫；2D：注射ALA組真皮內(nèi)炎癥細胞較少

注射ALA 組3 只大鼠耳廓可見輕度瘢痕形成，而有文獻報道外敷ALA?PDT 可治療兔耳增生性瘢痕模型［8］，故我們認為，注射ALA?PDT 治療后小部分大鼠耳廓注射部位有結(jié)痂，可能是注射手法、深淺未控制好，或是因為注射ALA后照光，局部光化學反應(yīng)過強而在愈合后形成瘢痕，這有待在今后的研究中擴大樣本進行觀察。肝腎功檢測結(jié)果顯示，注射ALA組、外敷ALA組與正常對照組比較，各指標均無統(tǒng)計學差異，提示注射ALA?PDT 安全，并未增加不良反應(yīng)。

綜上所述，本研究顯示，注射ALA?PDT 治療大鼠痤瘡樣炎性結(jié)節(jié)模型較外敷ALA?PDT 能顯著提高療效，減少炎性結(jié)節(jié)和炎癥細胞數(shù)，且未見肝腎功能損害，提示注射ALA?PDT 治療中重度痤瘡有效且安全，但能否應(yīng)用于痤瘡患者，以及有無遠期不良反應(yīng)，還需進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突