水牛SIRT6 基因shRNA 干擾慢病毒載體構(gòu)建與驗(yàn)證

程雋如，楊素芳，崔佳瑜，石德順，鄧彥飛

（廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530004）

Sirtuins 是一類(lèi)高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴(lài)性酶，哺乳動(dòng)物有7 個(gè)不同的Sirtuins（SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7），它們位于不同的細(xì)胞區(qū)室，具有多種催化活性。其中，SIRT6定位于細(xì)胞核，目前已知具有3 種酶活性，即NAD+依賴(lài)性組蛋白去乙?；竅1]、單ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶[2]和長(zhǎng)鏈脂肪酸酯酶[3]，SIRT6通過(guò)數(shù)種催化功能在細(xì)胞及生物個(gè)體上參與多項(xiàng)生理活動(dòng)。一方面，SIRT6基因是哺乳動(dòng)物重要的長(zhǎng)壽基因之一。Mostoslavsky 等[4]在缺乏SIRT6基因的小鼠中觀察到脊柱彎曲異常、皮下脂肪急性損失、淋巴細(xì)胞嚴(yán)重減少、代謝紊亂、壽命縮短等早衰癥狀，而SIRT6過(guò)表達(dá)可延長(zhǎng)雄性（而非雌性）的壽命15%[5]。另一方面，SIRT6 通過(guò)維護(hù)端粒、促進(jìn)DNA 雙鏈損傷修復(fù)和堿基切除修復(fù)維持基因的穩(wěn)定性[6]。同時(shí)，SIRT6 是能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，SIRT6 通過(guò)降低Hif1α的活性抑制糖酵解[7]，通過(guò)抑制肝臟糖異生減少葡萄糖的生成[8]、抑制甘油三酯的合成和脂肪酸的攝取、促進(jìn)脂肪酸的β-氧化等代謝活動(dòng)，從而維持代謝穩(wěn)態(tài)[9-10]。此外，SIRT6 還參與干細(xì)胞的重編程[11]、癌癥的發(fā)生和發(fā)展[12]、炎癥反應(yīng)[13]等生物活動(dòng)。目前，研究人員正在確定靶向SIRT6 的治療劑，這些治療劑可能在衰老、癌癥、神經(jīng)退行性疾病，心臟病、肥胖癥和糖尿病[14-18]等多種人類(lèi)疾病中具有廣泛的用途。

不僅如此，SIRT6 在畜牧業(yè)中也有應(yīng)用性研究。Gui 等[19]在秦川牛SIRT6基因外顯子區(qū)發(fā)現(xiàn)4 個(gè)SNP位點(diǎn)并證實(shí)SIRT6 多態(tài)性與個(gè)體的背膘厚度、肌內(nèi)脂肪含量和眼肌面積等胴體質(zhì)量性狀有關(guān)。Rincon 等[20]研究也表明SIRT6基因的多態(tài)性與育肥牛的胴體品質(zhì)和生長(zhǎng)效率性狀有關(guān)。此外，SIRT6 啟動(dòng)子區(qū)的SNP 位點(diǎn)與肉牛脂肪沉積有關(guān)[21]。這些研究表明SIRT6 在牛群標(biāo)記輔助選擇以及改善肉質(zhì)方面至關(guān)重要。

目前，SIRT6 在人與小鼠上的研究較為廣泛，在家畜上研究較少，并且尚未有水牛SIRT6 相關(guān)研究報(bào)道，故水牛SIRT6基因?qū)?xì)胞功能的研究具有重要意義。本研究以水牛胎兒成纖維細(xì)胞作為研究模型，構(gòu)建SIRT6基因RNA 干擾慢病毒載體，并鑒定轉(zhuǎn)染的有效性，為該基因在水牛上的研究與運(yùn)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、水牛胎兒成纖維細(xì)胞、293T 細(xì)胞、Psi-LVRU6GP 慢病毒質(zhì)粒、VSVG 包膜質(zhì)粒及NRF 包裝質(zhì)粒均為廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 Trizol 試劑購(gòu)自Invitrogen 公司；PCR試劑金牌 Mix（green） Golden Star T6 Super PCR Mix購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物公司；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自北京天根化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR 定量試劑均購(gòu)自諾唯贊公司；去內(nèi)毒質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA 公司；LB 培養(yǎng)基購(gòu)自北京金橋科技公司；Taq 酶、內(nèi)切酶（EcoRI和BamHI）和T4 連接酶購(gòu)自TaKaRa 公司；胎牛血清（FBS）、DMEM 細(xì)胞完全培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS 緩沖液、青鏈霉素等購(gòu)自Gibco 公司；多聚賴(lài)氨酸（Poly-D-lysine）購(gòu)自Sigma 公司；羅氏轉(zhuǎn)染試劑（X-tremeGENE HP DNA）購(gòu)自Rhoce 公司；引物合成和序列測(cè)定在上海生工進(jìn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 shRNA 的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)THEROMO FISHER 公司的siRNA 在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/），針對(duì)本實(shí)驗(yàn)室前期擴(kuò)增出的水牛SIRT6基因的CDS（Coding Sequence）序列[22]篩選干擾序列，由于該網(wǎng)站沒(méi)有牛和水牛的基因庫(kù)，于是比對(duì)了人、鼠的基因庫(kù)，最后挑選出2 條保守性較好、分值較高的目標(biāo)序列進(jìn)行shRNA 設(shè)計(jì)，目標(biāo)序列見(jiàn)表1。shRNA 序列設(shè)計(jì)原則：F 鏈5'→3'按照酶切位點(diǎn)（BamHI）、干擾序列、loop 環(huán)（TCAAGAG）、干擾序列的反向互補(bǔ)序列、中止信號(hào)（TTTTTT）、酶切位點(diǎn)（EcoRI）的順序；R 鏈5' →3' 按照酶切位點(diǎn)（EcoRI）、中止序列的互補(bǔ)序列（AAAAAA）、干擾序列、loop 環(huán)的反向互補(bǔ)序列（CTCTTGA）、干擾序列的反向互補(bǔ)序列、酶切位點(diǎn)（BamHI）的順序。

1.3.2 慢病毒干擾載體的構(gòu)建及驗(yàn)證 將合成好的寡核苷酸單鏈經(jīng)退火后形成雙鏈shRNA，產(chǎn)物與Psi-LVRU6GP 載體分別用BamHI 和EcoRI 限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，分別回收酶切產(chǎn)物，利用T4 連接酶將回收的雙鏈shRNA 與線性化的Psi-LVRU6GP 載體進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系：線性化的Psi-LVRU6GP 載體100 ng、雙鏈shRNA 500～1 000 ng、T4 DNA ligase1 μL、10×T4 DNA ligase Buffer 2 μL、50% PEG 4000 solution 2 μL，ddH2O 補(bǔ)至20 μL，混勻后置于16 ℃環(huán)境過(guò)夜。連接產(chǎn)物分別命名為Psi-sh1-LVRU6GP、Psi-sh2-LVRU6GP，設(shè)未連接干擾序列的空白質(zhì)粒為陰性對(duì)照（Negative Control，NC），命名為Psi-NC-LVRU6GP。連接完后進(jìn)行轉(zhuǎn)化、挑菌，以菌液為模板進(jìn)行PCR 鑒定、測(cè)序驗(yàn)證，重組質(zhì)粒驗(yàn)證成功后可進(jìn)行去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取。

表1 水牛SIRT6 shRNA 干擾序列

1.3.3 慢病毒包裝 293T 細(xì)胞和水牛胎兒成纖維細(xì)胞37℃復(fù)蘇后，在37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)60%～70%時(shí)轉(zhuǎn)染。取500 μL 無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM，目的質(zhì)粒與慢病毒包裝載體NRF、VSVG 按照質(zhì)量比5:3:2 混合，再加入轉(zhuǎn)染試劑X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent（目的質(zhì)?！棉D(zhuǎn)染試劑=1:1.5），混勻，室溫孵育15 min 后，逐滴加入293T細(xì)胞培養(yǎng)液中；12～24 h 內(nèi)更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染60 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，即病毒液，用0.45 μm 的濾器過(guò)濾、分裝后置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 慢病毒感染水牛成纖維細(xì)胞 將BFF 解凍復(fù)蘇后，傳至第4 代，待細(xì)胞匯合度為60% 左右時(shí)，每皿細(xì)胞分別加入1 mL 病毒液和2 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液，再添加6 μg/mL Polybrene 促進(jìn)感染。在第1 次病毒感染16～18 h 后棄細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行第2 次感染，加入1 mL 病毒液和2 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液重新感染至細(xì)胞匯合度至95%以上，觀察綠色熒光表達(dá)情況，并傳代進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每處理重復(fù)3 次，以未轉(zhuǎn)染外源基因的細(xì)胞為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染Psi-LVRU6GP 空載體作為質(zhì)粒對(duì)照組。

1.3.5 水牛成纖維細(xì)胞SIRT6基因的mRNA 表達(dá) 用Trizol法分別提取2 個(gè)處理組與2 個(gè)對(duì)照組水牛成纖維細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以β-actin為內(nèi)參基因，通過(guò)qRT-PCR 反應(yīng)檢測(cè)SIRT6基因的mRNA 表達(dá)量。反應(yīng)體系20 μL：上、下游引物各0.4 μL，模板（100 ng/μL）1 μL，2× chamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，三蒸水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s、60℃退火50 s，變性、退火40 個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表2。每個(gè)樣本重復(fù)3 次，采用2－△△CT方法計(jì)算目的基因的表達(dá)情況。

表2 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 熒光定量PCR 采用2－△△CT方法進(jìn)行計(jì)算，每處理重復(fù)3 次；數(shù)值用SPSS Statistics 軟件單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；以P<0.05 為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒干擾載體的構(gòu)建及驗(yàn)證 用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI 和EcoRI 雙酶切Psi-LVRU6GP 空白載體，回收線性化的載體。用T4 連接酶將shRNA 目的序列與線性化載體連接后，重組質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖1-A）及測(cè)序驗(yàn)證（圖1-B），成功獲得Psi-sh1-LVRU6GP，Psi-sh2-LVRU6GP 2 個(gè)干擾載體。

圖1 Psi-shRNA 重組載體序列鑒定

2.2 慢病毒包裝 將Psi-sh1-LVRU6GP、Psi-sh2-LVRU6GP及Psi-NC-LVRU6GP 質(zhì)粒分別與NRF 和VSVG 共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒包裝。轉(zhuǎn)染48 h 后，熒光顯微鏡觀察到明顯的綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）表達(dá)（圖2），轉(zhuǎn)染效率達(dá)70%以上，細(xì)胞狀態(tài)正常。

圖2 慢病毒包裝48 h 后GFP 表達(dá)（100

2.3 慢病毒感染水牛成纖維細(xì)胞 收集病毒懸×）液，分別感染第4 代水牛胎兒成纖維細(xì)胞，感染36 h 后，2 個(gè)shRNA 干擾組與質(zhì)粒對(duì)照組均可觀察到GFP 表達(dá)，而空白對(duì)照組無(wú)GFP 表達(dá)（圖3）。以上結(jié)果表明，所構(gòu)建的shRNA 干擾載體能成功轉(zhuǎn)入水牛胎兒成纖維細(xì)胞，并表達(dá)。

圖3 病毒液感染BFF 36h 后GFP 表達(dá)（100

2.4 水牛SIRT6基因shRNA 干擾效率的鑒定× ） 分別收集2 個(gè)shRNA 干擾組、質(zhì)粒對(duì)照組和空白對(duì)照組中BFF，通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)SIRT6表達(dá)水平來(lái)判斷shRNA 的干擾效率。如圖4 所示，干擾質(zhì)粒均能夠有效抑制BFF 細(xì)胞中SIRT6基因的表達(dá)，blank、Psi-NCLVRU6GP、Psi-sh1-LVRU6GP、Psi-sh2-LVRU6GP 表達(dá)量分別為1.00、0.86、0.34、0.06，2 個(gè)shRNA 干擾與質(zhì)粒對(duì)照組相比均差異顯著。其中Psi-sh2-LVRU6GP感染組SIRT6表達(dá)量最低，干擾效率最高。

3 討 論

圖4 慢病毒感染后SIRT6 表達(dá)差異

SIRT6 是一種復(fù)雜的酶，具有多種底物和催化活性，最主要的是NAD+依賴(lài)性組蛋白去乙酰化酶活性。目前已知的底物有組蛋白H3 第9 位賴(lài)氨酸殘基（H3K9）[23]、組蛋白H3 第56 位賴(lài)氨酸殘基（H3K56）[24]、組蛋白H3第18 位賴(lài)氨酸殘基（H3K18）[25]。Michishita 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，敲低人的胚胎肺成纖維細(xì)胞（WI-38）SIRT6基因之后H3K9 超乙?；琀3K9 成為首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的SIRT6 酶活底物。隨后有研究表明，H3K56 乙?；皆赟IRT6基因敲除的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）中顯著增加[24]。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中SIRT6 的失活導(dǎo)致H3K18 過(guò)度乙?；彤惾旧|(zhì)周?chē)D(zhuǎn)錄物的異常積累[25]。SIRT6對(duì)這些靶點(diǎn)的去乙?；饔脤?duì)于染色質(zhì)壓縮、轉(zhuǎn)錄抑制和DNA 損傷修復(fù)非常重要[1]。此外，SIRT6 還具有其他酶促機(jī)制和底物，它參與DNA 修復(fù)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的幾種非組蛋白去乙?；痆26]，促進(jìn)某些DNA 修復(fù)和染色質(zhì)沉默因子的ADP-核糖基化[2]、催化長(zhǎng)鏈脂肪?；拿擋Ｗ饔肹3]，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生物過(guò)程。

慢病毒載體是以人類(lèi)免疫缺陷型病毒（HIV）為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的新型基因載體，干擾載體包裝后感染目的細(xì)胞是目前基因沉默中較為直接高效的辦法。shRNA在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄為siRNA，siRNA 可以定位同源目的序列，與之結(jié)合并切割達(dá)到基因沉默目的，siRNA 具有放大效應(yīng)，因此只需要少許siRNA 便可高效沉默[27]。慢病毒感染不分細(xì)胞時(shí)期，相對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒以及腺病毒具有制毒周期短、感染效率和外源基因整合效率高的優(yōu)點(diǎn)，是導(dǎo)入外源基因高效有力的方法[28]。

基于上述情況，本研究利用慢病毒載體干擾技術(shù)，設(shè)計(jì)2 條針對(duì)SIRT6基因的shRNA 干擾序列，構(gòu)建2 種抑制SIRT6基因表達(dá)的慢病毒載體，經(jīng)慢病毒包裝，感染細(xì)胞后通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR 在mRNA 水平上檢驗(yàn)其轉(zhuǎn)染的有效性，篩選出干擾效率最優(yōu)的Psi-sh2-LVRU6GP 慢病毒載體。此外，本實(shí)驗(yàn)的慢病毒載體攜帶 GFP，可以直觀地通過(guò)綠色熒光的數(shù)量和強(qiáng)度觀察轉(zhuǎn)染效率。病毒液感染細(xì)胞后可得抑制SIRT6基因表達(dá)的細(xì)胞株，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)比BFF 過(guò)表達(dá)SIRT6基因和正常表達(dá)SIRT6基因細(xì)胞株中基因穩(wěn)定性、細(xì)胞衰老、代謝功能等提供依據(jù)，也為該基因在水牛上的研究與運(yùn)用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了2 種RNA 干擾SIRT6基因表達(dá)的慢病毒重組質(zhì)粒，經(jīng)慢病毒包裝感染水牛成纖維細(xì)胞后檢測(cè)SIRT6mRNA 表達(dá)水平，2 個(gè)干擾質(zhì)粒均能顯著下調(diào)SIRT6的表達(dá)，最終篩選出干擾效率最高的載體：Psi-sh2-LVRU6GP。為進(jìn)一步研究SIRT6在BFF 細(xì)胞上的功能提供良好的手段和工具。