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    柚皮苷對(duì)3T3-L1 脂肪細(xì)胞凋亡的影響

    2020-09-18 03:49:04霍子?xùn)|蔣亞東李澤強(qiáng)
    中國(guó)畜牧雜志 2020年9期
    關(guān)鍵詞:柚皮苷前體試劑盒

    霍子?xùn)|,王 琪,蔣亞東,李澤強(qiáng),王 敬,肖 融*

    (1.甘肅省畜牧技術(shù)推廣總站,甘肅蘭州 730030;2.重慶市畜牧科學(xué)院,重慶 602460;3.重慶市璧山區(qū)大興鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心,重慶 402760;4.瀘州市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展促進(jìn)中心,四川瀘州 646000)

    柚皮苷(Naringin)全稱4,5,7-三羥基-黃烷酮-7-鼠李糖葡萄糖苷,是一種二氫黃酮類化合物,天然存在于蕓香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中[1]。柚皮苷具有抗炎[2]、抗氧化[3]和調(diào)控脂肪代謝[4]等多種生物學(xué)功能,在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和畜禽生產(chǎn)中均有較好的應(yīng)用價(jià)值。脂肪代謝及脂肪調(diào)控對(duì)于維持動(dòng)物健康和改良畜禽肉品質(zhì)具有十分重要的意義。柚皮苷作為一種新型飼料添加劑,能減少動(dòng)物脂肪沉積。Hagertheodorides 等[5]在Ross308 肉雞飼料中添加柚皮苷,發(fā)現(xiàn)腹部脂肪重量顯著下降,且胸肌中棕櫚酸含量降低,多不飽和脂肪酸含量升高。體外試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)柚皮苷可抑制3T3-L1 脂肪細(xì)胞的增殖和成脂分化[6-7],但其是否通過促進(jìn)脂肪細(xì)胞凋亡來減少脂肪沉積的作用機(jī)制尚不明確。因此,本試驗(yàn)用不同濃度柚皮苷處理3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞,探討柚皮苷對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡的影響,為柚皮苷在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料 3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);DMEM/F12 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于Gibco 公司;胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松和羅格列酮購(gòu)自Sigma 公司;柚皮苷(純度≥98.0%)購(gòu)自索萊寶公司;hoechst 染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;Binding Buffer 緩沖液、Annexin-V 和PI 購(gòu)自里來生物科技有限公司;RNA 提取試劑和RT-PCR 反應(yīng)試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司;RIPA 裂解液和BCA 試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;5×SDS 上樣緩沖液、Bax 抗體、APAF-1 抗體、GAPDH 抗體和山羊抗兔二抗購(gòu)自Cell Signaling Technology 公司;12%SDS-PAGE膠購(gòu)自invitrogen 公司;ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自biobad 公司。

    1.2 3T3-L1 細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化 3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后,用DMEM 高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),在37℃,體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為誘導(dǎo)分化,當(dāng)細(xì)胞完全融合后,將培養(yǎng)基換為分化培養(yǎng)基(即DMEM 培養(yǎng)基中含5 μg/mL 胰島素,0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤,1 μmol/L 地塞米松,1 μmol/L羅格列酮和10%胎牛血清)。2 d 后,換為維持培養(yǎng)基(即DMEM 培養(yǎng)基中含5 μg/mL 胰島素和10%胎牛血清),每2 d 更換1 次培養(yǎng)基,共誘導(dǎo)分化8 d 后,在顯微鏡下觀察,細(xì)胞周圍已形成明顯脂滴,即已將前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞[8]。

    1.3 柚皮苷處理 前體脂肪細(xì)胞(未分化)和成熟脂肪細(xì)胞(分化細(xì)胞)均培養(yǎng)在DMEM 高糖培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清),并分別在其培養(yǎng)基中加入不同濃度(0、50、200、600 μmol/L)柚皮苷,0 μmol/L 為對(duì)照組,處理24 h 后用于試驗(yàn)檢測(cè),每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

    1.4 Hoechst 染色 根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作,用固定液固定脂肪細(xì)胞10 min,去掉固定液后用PBS 清洗2 次。加入Hoechst 33258 染色液,染色5 min,去掉染色液后用PBS 清洗2 次后即置于熒光顯微鏡下觀察拍照,激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm。

    1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)脂肪細(xì)胞凋亡率 收集脂肪細(xì)胞后,加入500 μL Binding Buffer 緩沖液重懸細(xì)胞,加入5 μL Annexin-V、5 μL PI 混勻,避光孵育10 min 后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

    1.6 熒光定量PCR 檢測(cè)凋亡因子mRNA 表達(dá) RNA 的提取參照試劑盒說明書,提取的RNA 經(jīng)過濃度和純度檢測(cè)后,參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank 中的基因序列設(shè)計(jì)引物,由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1),GAPDH為管家基因。按照TaKaRa 熒光定量PCR 試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ)和Real-Time PCR System 的使用說明進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL:SYBR qPCR Mix 10 μL,cDNA 4 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,ROX reference Dye Ⅱ 0.4 μL,ddH2O 4 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性5 s,60℃退火34 s,共40 個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。應(yīng)用SPSS17.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA),P<0.05 表示差異顯著。

    1.7 Western blotting 測(cè)定凋亡因子蛋白表達(dá) 使用RIPA 裂解液提取總蛋白。用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度,以5×SDS 上樣緩沖液與蛋白樣品1:4 比例混合,金屬浴100℃中5 min 使蛋白完全變性,上樣。12%的SDS-PAGE 膠進(jìn)行蛋白分離,然后轉(zhuǎn)印到0.22 μm PVDF 膜上,5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h 后加封閉液配置的一抗4℃孵育過夜,TBST 洗膜5 次后,加入封閉液配置的二抗室溫孵育1 h 后洗膜3 次。最后用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒和自動(dòng)發(fā)光曝光儀進(jìn)行顯色拍照分析。

    2 結(jié)果

    2.1 柚皮苷對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡的影響 由圖1 所示,柚皮苷處理未導(dǎo)致前體脂肪細(xì)胞凋亡。在成熟脂肪細(xì)胞中,柚皮苷處理導(dǎo)致細(xì)胞呈致密濃染,細(xì)胞核顏色呈亮白色增多,表明柚皮苷引起了成熟脂肪細(xì)胞凋亡;與200、600 μmol/L 柚皮苷組相比,50 μmol/L 柚皮苷組的細(xì)胞凋亡特征更明顯。

    表1 熒光定量PCR 引物序列

    流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的結(jié)果與hoechst 染色結(jié)果基本一致。柚皮苷處理幾乎未引起前體脂肪細(xì)胞凋亡率升高。在成熟脂肪細(xì)胞中,添加不同濃度柚皮苷均上調(diào)了細(xì)胞凋亡率,且50 μmol/L 柚皮苷處理導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡率更高(圖2)。從脂肪細(xì)胞形態(tài)和脂肪細(xì)胞凋亡率兩方面看,柚皮苷處理導(dǎo)致了成熟脂肪細(xì)胞誘凋亡,而未引起前體脂肪細(xì)胞凋亡。

    2.2 柚皮苷對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡因子mRNA 表達(dá)的影響 熒光定量PCR 結(jié)果表明(圖3),柚皮苷對(duì)前體脂肪細(xì)胞中凋亡基因的表達(dá)無顯著影響。與對(duì)照組相比,50 μmol/L 柚皮苷顯著上調(diào)了成熟脂肪細(xì)胞中促凋亡因子Bax、Bcl-2、PARP和APAF-1的mRNA 表達(dá)量。200、600 μmol/L 柚皮苷處理對(duì)上述促凋亡因子的mRNA 表達(dá)無顯著影響。

    2.3 柚皮苷對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡因子蛋白表達(dá)的影響 由圖4 可見,柚皮苷處理幾乎未導(dǎo)致前體脂肪細(xì)胞中促凋亡蛋白表達(dá)的變化,僅600 μmol/L 柚皮苷處理對(duì)Bax 和APAF-1 的蛋白表達(dá)水平有一定程度的上調(diào)。在成熟脂肪細(xì)胞中,添加不同濃度柚皮苷均不同程度地上調(diào)了Bax 和APAF-1 的表達(dá),且50 μmol/L 柚皮苷處理的作用最強(qiáng)。

    圖1 柚皮苷對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡的影響

    圖2 柚皮苷對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡率的影響

    圖3 柚皮苷對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡因子mRNA 表達(dá)的影響

    圖4 柚皮苷對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡因子蛋白表達(dá)的影響

    3 討 論

    柚皮苷作為一種新型飼料添加劑,能減少動(dòng)物脂肪沉積,抑制3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞增殖分化[9],但目前柚皮苷與脂肪細(xì)胞凋亡之間的調(diào)控關(guān)系還不明確?,F(xiàn)有研究表明,與柚皮苷類似的一些天然活性物質(zhì)能促進(jìn)脂肪細(xì)胞凋亡。Singh 等[10]研究發(fā)現(xiàn),千層紙素A 抑制了3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞增殖,可能與誘導(dǎo)了前體脂肪細(xì)胞凋亡有關(guān);千層紙素A 還減少了成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積累,并通過刺激促凋亡蛋白Bax、細(xì)胞色素C(CYTC)和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外,染料木黃酮也能促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞凋亡[11-12]。千層紙素A 和染料木黃酮都屬于黃酮類物質(zhì),本試驗(yàn)中柚皮苷也是一種黃酮類物質(zhì),但柚皮苷僅誘導(dǎo)了成熟脂肪細(xì)胞凋亡并促進(jìn)了相關(guān)促凋亡因子的表達(dá),而未引起前體脂肪細(xì)胞凋亡;表明即使同屬黃酮類物質(zhì),但由于分子結(jié)構(gòu)等不同,使得它們對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡的影響也不完全一致。Lin 等[13]也發(fā)現(xiàn)兒茶素能增加成熟脂肪細(xì)胞凋亡,而不影響前體脂肪細(xì)胞的生存能力,說明同一物質(zhì)對(duì)不同分化狀態(tài)的脂肪細(xì)胞具有差異的調(diào)控作用。此外,Guo 等[7]研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷可顯著抑制3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞增殖,但其并未就柚皮苷是否通過誘導(dǎo)前體脂肪細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖進(jìn)行深入研究,而本試驗(yàn)結(jié)果表明柚皮苷處理未導(dǎo)致3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞凋亡,提示柚皮苷對(duì)3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞增殖的抑制作用不是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。

    黃酮類天然活性物質(zhì)作用于細(xì)胞凋亡過程中的多個(gè)基因和信號(hào)通路。柚皮素通過降低抗凋亡蛋白蘇氨酸激酶(p-Akt)的表達(dá)以及增加促凋亡蛋白Bax 表達(dá),從而促進(jìn)人脂肪前細(xì)胞系A(chǔ)ML-I 細(xì)胞凋亡[14]。另有試驗(yàn)證明,人參皂苷Rh2 通過Akt/Bax/caspase9 途徑誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞系NB4 細(xì)胞凋亡[15]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),柚皮苷上調(diào)了Bax mRNA 和蛋白表達(dá)水平,提示柚皮苷可能通過Akt/Bax 途徑誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞凋亡。此外,納曲酮能激活Bax/Bcl-2/caspase-3/PARP 信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡[16]。Kwak 等[17]研究表明,甘草查耳酮通過影響促凋亡因子Bax、Bcl-2、CYTC、APAF-1 和PARP 等的蛋白水平,進(jìn)而誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞凋亡。雖然與上述研究中的細(xì)胞類型有差異,但本研究中柚皮苷通過提高Bax、Bcl-2、APAF-1和PARP的表達(dá)水平誘導(dǎo)成熟脂肪細(xì)胞凋亡的試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果類似。研究還發(fā)現(xiàn),黃酮類物質(zhì)的抗脂肪沉積作用與AMPK通路和Wnt 通路活化誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡有關(guān)[18-20],但柚皮苷對(duì)上述信號(hào)通路的調(diào)控作用尚需進(jìn)一步探究。

    4 結(jié) 論

    本研究結(jié)果表明,50、200、600 μmol/L 柚皮苷處理未導(dǎo)致3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞凋亡;50 μmol/L 柚皮苷能通過上調(diào)促凋亡因子Bax、Bcl-2、PARP和APAF-1的mRNA 表達(dá)以及Bax 和APAF-1 的蛋白表達(dá)來誘導(dǎo)3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞凋亡,進(jìn)而減少動(dòng)物脂肪沉積。

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