糖皮質(zhì)激素對(duì)抗血清剝奪誘導(dǎo)的小鼠肝癌細(xì)胞凋亡作用及機(jī)制研究

王貴平，曹明月，李高翔，黃 薇，楊 楠，劉雁勇

(1.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西藏 拉薩 850000；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院藥理學(xué)系，北京 100005)

研究表明持續(xù)精神應(yīng)激嚴(yán)重影響癌癥的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后[1～4]。精神應(yīng)激誘導(dǎo)下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸活化導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GCs)釋放，通過作用于糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而影響腫瘤的轉(zhuǎn)歸[5]。GR是一種核激素受體超家族蛋白，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的GR與糖皮質(zhì)激素結(jié)合后被磷酸化激活，隨后在熱休克蛋白HSP90的協(xié)助下轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，與糖皮質(zhì)激素反應(yīng)原件(glucocorticoid-response elements，GRE)結(jié)合，作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控靶基因的激活或抑制[5]。在臨床中，糖皮質(zhì)激素被廣泛用于腫瘤的一線或聯(lián)合治療。但是最近的研究顯示，糖皮質(zhì)激素能誘導(dǎo)化療抵抗、促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。因此深入探討糖皮質(zhì)激素在腫瘤發(fā)展過程中的作用及機(jī)制，將有利于促進(jìn)臨床合理應(yīng)用及發(fā)展新型干預(yù)策略。本研究以小鼠肝癌細(xì)胞系H22為研究對(duì)象，血清剝奪誘導(dǎo)H22細(xì)胞凋亡并模擬惡性腫瘤增殖過程中低血供狀態(tài)，探討內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2018年9月至2019年12月。小鼠肝癌細(xì)胞系H22源自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫(kù)；RPMI-1640培養(yǎng)基和雙抗(青霉素、鏈霉素)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；皮質(zhì)酮(Corticosterone：HBC complex，CORT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RU486購(gòu)自上海陶素生化科技有限公司；Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司；β-actin、GAPDH抗體購(gòu)自ABclonal公司；GR、Hsp90抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記馬抗小鼠 IgG二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠肝癌細(xì)胞系H22在添加了10%FBS和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放置于37 ℃、含5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 血清剝奪誘導(dǎo)H22細(xì)胞凋亡，同時(shí)添加糖皮質(zhì)及激素CORT及糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486，利用流式細(xì)胞術(shù)染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平變化。取對(duì)數(shù)增殖期的H22細(xì)胞，以5×104cells/ml的細(xì)胞密度接種于6孔板中，每孔2 ml培養(yǎng)基。細(xì)胞分組為：對(duì)照組(10%FBS)、血清剝奪組(0%FBS)、CORT組(0%FBS，添加終濃度為0.25、0.5、1 μmol/L的CORT)、RU486組(0%FBS，添加終濃度為1 μmol/L的RU486)和CORT+RU486組(0%FBS，添加終濃度均為1 μmol/L的CORT和RU486)。血清剝奪及CORT或RU486給藥處理24 h后收集細(xì)胞，用Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平變化。具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書和參考文獻(xiàn)[7]。即：1000 rpm室溫離心5 min，棄上清，PBS洗2次，加入適量1×染色結(jié)合液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106cells/ml，每100 μl細(xì)胞懸液添加5 μl FITC-Annexin V抗體和5 μl PI染液，室溫避光孵育15 min，加入400 μl 1×染色結(jié)合液。1 h內(nèi)用BD AccuriTM C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用FlowJo 10.5.3軟件進(jìn)行分析。

1.2.3蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)GR和Hsp90蛋白表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)增殖期的H22細(xì)胞，以8×104cells/mL的細(xì)胞密度，10 ml RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%FBS)，接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿。將細(xì)胞分為對(duì)照組組和CORT組。對(duì)照組不給藥，CORT組添加終濃度為1 μmol/L的CORT。48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞各組分蛋白后進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Hsp90和GR蛋白表達(dá)，具體實(shí)驗(yàn)步驟為：細(xì)胞中添加適量胞質(zhì)蛋白提取緩沖液，4 ℃ 4200 g離心5 min，收集上清，即為胞質(zhì)蛋白；細(xì)胞沉淀重懸于適量可溶性核蛋白提取緩沖液，冰上孵育30 min，4 ℃，5000 g離心5 min，收集上清，即為可溶性核蛋白；細(xì)胞沉淀重懸于適量染色質(zhì)結(jié)合核蛋白提取緩沖液，隔水超聲，4 ℃，5000 g離心5 min，收集上清，即為染色質(zhì)結(jié)合核蛋白。BCA法蛋白定量并調(diào)整至相同蛋白濃度后進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印記實(shí)驗(yàn)，于80 V恒壓凝膠電泳3 h，100 V、2 h恒壓電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃過夜孵育GR和Hsp90一抗，室溫1 h孵育二抗。按照說明書均勻孵育ECL顯影液后用天能化學(xué)發(fā)光成像儀曝光并拍照。使用軟件Gel-Pro analyzer分析各蛋白條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白/內(nèi)參蛋白條帶灰度值表示相對(duì)蛋白表達(dá)，采用百分比歸一化法統(tǒng)計(jì)分析組間蛋白表達(dá)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較進(jìn)行方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮質(zhì)酮對(duì)血清剝奪誘導(dǎo)的H22細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組比較，血清剝奪后H22細(xì)胞凋亡水平顯著升高(P<0.01)；與血清剝奪組相比，0.25、0.5和1.0 μmol/L CORT處理后，H22細(xì)胞凋亡比例顯著降低(P<0.05)，并呈現(xiàn)劑量依賴性，依次為48.51%、48.28%和38.44%；CORT和GR拮抗劑RU486共處理后，H22細(xì)胞凋亡水平與1.0 μmol/L CORT組相比顯著升高(P<0.05)，凋亡比例回升至75.94%。見圖1。

2.2 皮質(zhì)酮上調(diào)GR和Hsp90的水平與對(duì)照組相比，CORT組H22細(xì)胞與染色質(zhì)結(jié)合核蛋白中GR表達(dá)水平升高了2.15倍，胞漿蛋白和可溶性核蛋白中Hsp90蛋白表達(dá)分別升高了1.62倍和1.65倍。見圖2。

圖1 各組H22細(xì)胞凋亡流式結(jié)果圖 a：凋亡流式結(jié)果圖；b：各組凋亡比例比較；c：晚期凋亡比例

圖2 各組H22細(xì)胞蛋白質(zhì)免疫印跡分析 a：蛋白免疫印跡結(jié)果；b：GR相對(duì)水平；c：HSP相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

由于血管發(fā)育不完善，在腫瘤組織內(nèi)部很多區(qū)域處于營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)，因而實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)對(duì)血液供應(yīng)具有很大的依賴性。當(dāng)血供不足時(shí)，腫瘤細(xì)胞將啟動(dòng)一系列的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。基礎(chǔ)和臨床研究均揭示了慢性精神應(yīng)激可以通過激活HPA軸促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，提示糖皮質(zhì)激素在增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞應(yīng)對(duì)不利環(huán)境可塑性方面發(fā)揮著重要作用。糖皮質(zhì)激素曾經(jīng)作為一線藥物用于白血病等腫瘤治療[8]，但是最近的研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素能促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移[6]，表明糖皮質(zhì)激素可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，但相關(guān)機(jī)制尚待闡明。本研究以小鼠肝癌細(xì)胞系H22為研究對(duì)象，探究糖皮質(zhì)激素對(duì)血清剝奪條件下腫瘤細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制。采用血清剝奪模擬實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)過程中的低血供狀態(tài)以誘導(dǎo)H22細(xì)胞凋亡。在血清剝奪條件下，利用糖皮質(zhì)激素CORT及糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486體外給藥來探討糖皮質(zhì)激素對(duì)H22細(xì)胞凋亡的影響。已有研究表明Hsp90作為一種分子伴侶，參與協(xié)助GR的核轉(zhuǎn)位[9]，因此本研究進(jìn)一步對(duì)正常血清培養(yǎng)條件下CORT處理后GR核轉(zhuǎn)位和Hsp90的表達(dá)水平進(jìn)行了分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，皮質(zhì)酮顯著抑制血清剝奪誘導(dǎo)的H22細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)H22細(xì)胞中GR核轉(zhuǎn)位以及升高Hsp90蛋白表達(dá)水平。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素可以抵抗血清剝奪誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞H22的凋亡，其機(jī)制可能與Hsp90協(xié)助下增強(qiáng)的GR核轉(zhuǎn)位有關(guān)。研究結(jié)果為慢性精神應(yīng)激下癌癥發(fā)生發(fā)展復(fù)雜的機(jī)制研究提供新的視角，并為臨床癌癥患者治療中糖皮質(zhì)激素的合理用藥提供參考依據(jù)。但是本研究?jī)H在體外進(jìn)行，未在動(dòng)物體內(nèi)做驗(yàn)證。后續(xù)將建立慢性精神應(yīng)激小鼠腫瘤模型，系統(tǒng)評(píng)價(jià)糖皮質(zhì)激素以及GR核轉(zhuǎn)位對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用，系統(tǒng)研究GR下游靶基因SGK1等的作用以明確其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。