5-Aza-CdR對HT22小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中NR2B磷酸化的影響*

姜樹原，王 強(qiáng)，張曉璐，劉 友，邵 國,3

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室，內(nèi)蒙古 包頭 014040;2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院；3.首都醫(yī)科大學(xué)低氧醫(yī)學(xué)研究所)

N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDARs)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要的生理作用，而且對神經(jīng)元回路的形成也發(fā)揮關(guān)鍵作用。NR是由多個NR2亞單位與NR1共同形成四聚體(或五聚體)。NR1是構(gòu)成離子通道的基本亞單位，NR2是調(diào)節(jié)亞單位，不同NR2組成的NMDA受體表現(xiàn)出不同的腦內(nèi)分布與生理學(xué)特性。在成人腦中，NR2A和NR2B亞基主要在皮層和海馬中表達(dá)[1-2]。小鼠前腦過表達(dá)NR2B，會提高其學(xué)習(xí)記憶能力而在各種行為任務(wù)中表現(xiàn)優(yōu)異[3]。

NR2B-Y1472的磷酸化與突觸可塑性和行為密切相關(guān)。經(jīng)過水迷宮訓(xùn)練，大鼠島葉皮層突觸后致密物(postsynaptic density，PSD)中NR2B-Y1472磷酸化水平升高[4]。5-氮雜-2-脫氧胞苷( 5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR)是一種甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，在表觀遺傳學(xué)研究中被廣泛用于抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMTs)的活性。5-Aza-CdR在誘導(dǎo)細(xì)胞周期的阻滯、分化、細(xì)胞死亡和動物行為學(xué)中起到了重要作用[5-8]。我們的研究表明，5-Aza-CdR可以影響小鼠在水迷宮中的行為，由于NR2B及其磷酸化在行為學(xué)中也起重要作用，所以，本研究將通過細(xì)胞實驗探討5-Aza-CdR對NR2B及其磷酸化的影響。

1 材料與方法

1.1實驗細(xì)胞 HT22細(xì)胞，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室提供。

1.2藥品與試劑 5-Aza-CdR購于美國Sigma-Aldrich公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBR Green qPCR Master Mix均購自日本TaKaRa公司；RIPA細(xì)胞裂解液、ECL發(fā)光液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶抑制劑Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail(100×)購自美國Thermo Fisher公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自美國Pierce公司；兔抗NR2B抗體購自美國CST公司；兔抗p-Y1472 NR2B抗體購自美國Phosphosolutions公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的驢抗兔二抗購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒均購自美國Promega公司。

1.3實驗儀器 ABI 7900 PCR儀購置于美國ABI公司；CantoⅡ流式細(xì)胞儀購于美國BD公司。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22 接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HT22細(xì)胞，用分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)24 h[9]。與此同時，將對照組細(xì)胞用0.1 % BSA處理，處理組細(xì)胞用10 μmol/L 5-Aza-CdR處理。

1.5RNA的提取和real time RT-PCR4 收集處理組和對照組細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞RNA，使用Nanodrop 2000檢測RNA的濃度和純度。取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。NR2B 上游引物：5'-AACCTTCACCTAGCCCCAG-3'，下游引物：5'-CTCATCCGATTTGGCTCTTTCA-3'；β-actin上游引物：5'-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3'，下游引物：5'-GGTCATTGATGGCAACAA-3'。使用20 μL反應(yīng)體系(cDNA 2 μL,引物1 μL,Mix 10 μL,ddH2O 7 μL)進(jìn)行反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min,40個循環(huán)(95 ℃ 15 s,59 ℃ 30 s,74 ℃ 30 s)，72 ℃總延伸2 min。Real time RT-PCR結(jié)果利用△△CT 法進(jìn)行分析，mRNA 相對豐度值F = 2-ΔΔCT。

1.6Western Blot 收集處理組和對照組細(xì)胞，加入RIPA裂解液(1 mL/mg)裂解細(xì)胞，同時加入Thermo Halt(100×)蛋白酶抑制劑至工作濃度，在冰上超聲后提取蛋白，應(yīng)用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，取20 μg的蛋白提取物進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5 %脫脂奶粉在室溫下封閉1 h后，加入兔抗NR2B、p-Y1472 NR2B、β-actin抗體(所有抗體稀釋濃度為1∶500)，4 ℃孵育16 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的驢抗兔二抗(1∶1000)，室溫孵育1 h。TBST洗3次，每次10 min，浸于適量的ECL化學(xué)發(fā)光劑中，使用Image J分析其灰度值。

1.7MTS檢測 將HT22細(xì)胞種于96孔板，用5-Aza-CdR或0.1 % BSA處理，根據(jù)CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit試劑盒說明書檢測細(xì)胞活力，每組重復(fù)3次。

1.8細(xì)胞周期檢測 將HT22細(xì)胞接種于100 mm 培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞生長到60 %～70 %時，用5-Aza-CdR或0.1 % BSA處理，按照BD公司試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞周期實驗。使用BD CantoⅡ檢測細(xì)胞周期，應(yīng)用ModFit 3.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.15-Aza-CdR對HT22細(xì)胞中NR2B和磷酸化NR2B -Y1472表達(dá)的影響 real time RT-PCR、Western Blot檢測結(jié)果顯示，用0.1 % BSA處理的對照組HT22細(xì)胞與用10 μmol/L 5-Aza-CdR處理的處理組HT22細(xì)胞比對，處理組與對照組之間NR2B的 mRNA和蛋白水平的變化沒有明顯差異(P>0.05)。見圖1A-B。5-Aza-CdR處理組磷酸化NR2B-Y1472的表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05)。見圖1C。

2.25-Aza-CdR對HT22細(xì)胞活力和細(xì)胞周期的影響 MTS檢測結(jié)果顯示，10 μmol/L的5-Aza-CdR可顯著降低HT22細(xì)胞的細(xì)胞活力(P<0.05)。見圖1A。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，10 μmol/L的5-Aza-CdR可將HT22細(xì)胞阻滯在G2/M期。見圖1B-C。

3 討論

5-Aza-CdR對細(xì)胞或組織的影響是一個復(fù)雜的機(jī)制。DNA甲基化在學(xué)習(xí)和記憶中發(fā)揮一定的作用[10]，我們先前研究發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR可以改善小鼠在水迷宮中的學(xué)習(xí)記憶能力[5]。NR2B和磷酸化NR2B-Y1472在學(xué)習(xí)和記憶功能中起著關(guān)鍵的作用[10-11]。目前尚不清楚5-Aza-CdR對動物行為的影響是否是由于NR2B-Y1472的磷酸化水平調(diào)控的，且不依賴于海馬細(xì)胞增殖。本研究使用了小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22細(xì)胞進(jìn)行體外試驗，10 μmol/L的5-Aza-CdR可抑制細(xì)胞活力，并且細(xì)胞周期被阻滯于G2/M期。因此，目前我們認(rèn)為動物行為能力的增強(qiáng)不是由于神經(jīng)元的增殖。另外，HT22細(xì)胞中5-Aza-CdR處理組NR2B的表達(dá)不變，磷酸化NR2B-Y1472表達(dá)水平增加。實驗數(shù)據(jù)顯示，5-Aza-CdR可影響小鼠行為學(xué)的變化與磷酸化NR2B-Y1472的表達(dá)變化有關(guān)。因此進(jìn)一步研究5-Aza-CdR調(diào)節(jié)腦中NR2B-Y1472磷酸化變化分子機(jī)制，對于利用5-Aza-CdR治療學(xué)習(xí)記憶相關(guān)疾病有潛在的臨床價值。