HPLC法測(cè)定興安柴胡中柴胡皂苷d的含量

郭司群 遲曉雪 白雅靜 王懷剛

1.呼倫貝爾市食品藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021008；2.呼倫貝爾市草原工作站，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021008

柴胡原名花胡，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品。藥用柴胡資源將近30種，主要分布于我國(guó)西南、西北和東北地區(qū)[1]?！吨袊?guó)藥典》1963年版收載了柴胡B.chinenseDC.和狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.；1977年版根據(jù)各地習(xí)用柴胡物種的實(shí)際情況，除收載上述兩種外，收載了“及其同屬數(shù)種植物”；《內(nèi)蒙古中藥材標(biāo)準(zhǔn)》1988年版收載興安柴胡藥材為傘形科植物興安柴胡BupleurumSibircumVest的干燥根。具有疏散退熱、舒肝、升陽(yáng)的功效。但標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)興安柴胡的含量進(jìn)行規(guī)定[2]。

研究證明柴胡屬植物含有柴胡皂苷、揮發(fā)油、甾醇類、萜類、生物堿、黃酮、木脂素、香豆素、有機(jī)酸、多糖、氨基酸、多肽、香豆精等成分。從柴胡屬多種植物中已分離出多種皂苷類成分。主要分布在根部。皂苷類成分中含量較高的有柴胡皂苷a、d[3]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立高效液相色譜法，對(duì)興安柴胡中皂苷d的含量測(cè)定進(jìn)行研究。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 KQ2200DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Sartorius BSA224S型、BP211D型電子天平(德國(guó)賽多利斯科技有限公司)； 島津LC-20AT型高效液相色譜儀(SCL-10ATvp型控制器，SPD-10Avp型二極管陣列檢測(cè)器，LCsolution色譜工作站)。

1.2 試藥與試劑 柴胡：樣品經(jīng)性狀與顯微鑒別確定為興安柴胡；對(duì)照品：柴胡皂苷d 來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110778-201711，純度95.8%；乙腈(色譜純Fisher Chemical)；甲醇(色譜純Fisher Chemical)；氨水(分析純)；自制純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters SunFireTMC18(5 μm,4.6 mm×250 mm)； 流動(dòng)相：乙腈-水(按下表進(jìn)行梯度洗脫)；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

時(shí)間/min流動(dòng)相A/%流動(dòng)相B/%0～5525→9075→1055～609010

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取柴胡皂苷d對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含柴胡皂苷d 0.5 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入含5%濃氨試液的甲醇溶液50 mL，密塞，30 ℃水溫超聲處理(功率200 w，頻率40 kHz)30 min，濾過(guò)，用甲醇40 mL分2次洗滌容器及藥渣，洗液與濾液合并，70 ℃水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。分別精密吸取對(duì)照品溶液20 μL與供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。如圖1和圖2所示。

圖1 柴胡皂苷d對(duì)照品溶液HPLC色譜圖

圖2 興安柴胡供試品溶液HPLC色譜圖

2.3 測(cè)定方法的選擇 由于柴胡皂苷類化合物的結(jié)構(gòu)中所含雙鍵很少，因此使用紫外檢測(cè)器時(shí)只能用末端吸收(203～210 nm)進(jìn)行檢測(cè)，雖然蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)檢測(cè)不依賴樣品光學(xué)性質(zhì)，可以消除流動(dòng)相配比變化對(duì)基線產(chǎn)生的影響，但受漂移管溫度、氣流速度等條件影響，測(cè)定過(guò)程相對(duì)復(fù)雜。所以本試驗(yàn)采用紫外檢測(cè)方式。雖然樣品容易受到流動(dòng)相等各種試劑的干擾使基線不穩(wěn)，影響定量，但可通過(guò)仔細(xì)地選擇色譜條件獲得較好的結(jié)果。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密稱定柴胡皂苷d對(duì)照品0.01265 g，置25 mL量瓶中，加甲醇適量使溶解，并加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含柴胡皂苷d 0.5 mg的儲(chǔ)備溶液。精密量取上述儲(chǔ)備溶液1 mL、2.5 mL、5 mL和7.5 mL分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成柴胡皂苷d的0.05 mg/mL、0.12 mg/mL、0.25 mg/mL和0.38 mg/mL系列濃度溶液。分別精密量取上述儲(chǔ)備溶液和系列濃度溶液各20 μL分別注入液相色譜儀，記錄峰面積，以濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。見(jiàn)表1。

表1 線性回歸方程

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密稱定柴胡皂苷d對(duì)照品0.01322 g，置25 mL量瓶中，加甲醇適量使溶解，并加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，柴胡皂苷d峰面積的RSD為1.0% ，表明精密度良好。見(jiàn)表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱定柴胡皂苷d對(duì)照品0.01239 g，置25 mL量瓶中，加甲醇適量使溶解，并加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件操作，測(cè)得柴胡皂苷d的峰面積，并將濾液分別放置2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后，按含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件分別注入液相色譜儀，記錄柴胡皂苷d的峰面積，RSD為0.2%，表明柴胡皂苷d溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。見(jiàn)表3。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取興安柴胡1號(hào)樣品5份，各約1.0 g，精密稱定，分別按含量測(cè)定項(xiàng)下方法操作，測(cè)得每份樣品中柴胡皂苷d的含量，結(jié)果見(jiàn)表4，表明重現(xiàn)性良好。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.5 回收率試驗(yàn) 取興安柴胡1號(hào)樣品(柴胡皂苷d含量為0.151%)9份，精密稱定，依次精密加入5.2項(xiàng)下柴胡皂苷d儲(chǔ)備溶液1.4 mL、1.4 mL、1.4 mL、1.8 mL、1.8 mL、1.8 mL、2.2 mL、2.2 mL、2.2 mL，分別按含量測(cè)定項(xiàng)下方法操作，測(cè)定每份中柴胡皂苷d的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.5 樣品含量測(cè)定 取7批興安柴胡樣品按含量測(cè)定項(xiàng)下方法處理并測(cè)定，7批樣品的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 柴胡皂苷d加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表6 7批樣品中柴胡皂苷d含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

柴胡皂苷為齊墩果烷型三萜皂苷，極性較大，易溶于甲醇、乙醇，常用溶劑法進(jìn)行提取。柴胡皂苷d因具有環(huán)氧醚鍵結(jié)構(gòu)而不穩(wěn)定，在酸性或高溫條件的影響下，其環(huán)氧醚鍵易開(kāi)環(huán)，因?yàn)楸敬螌?shí)驗(yàn)選擇超聲提取的方式。

參考2015年版《中國(guó)藥典》一部中柴胡含量測(cè)定項(xiàng)下的提取溶劑，故本次實(shí)驗(yàn)考察了水、甲醇和5%濃氨試液的甲醇溶液3種提取溶劑，結(jié)果表明5%濃氨試液的甲醇溶液提取柴胡皂苷d含量最高，水的提取柴胡皂苷d含量最低，故提取溶劑選擇5%濃氨試液的甲醇溶液。實(shí)驗(yàn)共考察了20 ℃、30 ℃和40 ℃3個(gè)超聲水溫，結(jié)果表明40 ℃水溫超聲對(duì)柴胡皂苷d有一定的影響，使其柴胡皂苷d的含量降低。20 ℃和30 ℃柴胡皂苷d的含量差別不大，但考慮到20 ℃水溫超聲溫度不宜控制恒定，故選擇30 ℃水溫超聲提取。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明建立的高效液相色譜法簡(jiǎn)便可行、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于興安柴胡的質(zhì)量控制。