野桑蠶Hippo通路核心基因的鑒定與序列比較分析

孟剛 彭云武 王瑞嫻

摘要：Hippo信號(hào)通路在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。根據(jù)已知的Hippo通路組成基因序列，利用BLAST軟件同源鑒定野桑蠶（Bombyx mandarina）轉(zhuǎn)錄組中的Hippo通路組成基因序列，利用生物信息學(xué)工具（ORFinder、web CD-search tool、Expasy-protparam、EMBL-EBI、MEME）分析蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和保守基序等。利用Clustalx和MEGA 6.0進(jìn)行同源序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。在野桑蠶中鑒定了salvador、warts、mats、yorkie和scalloped同源基因，并預(yù)測(cè)了ORF框和編碼蛋白。結(jié)果表明，野桑蠶Warts、Sav和Mats與家蠶同源蛋白的一致性均在98%以上，Yki和Scalloped與家蠶一致性分別為89.02%和79.13%。比較兩者差異，家蠶Yki、Sd蛋白分別缺失了近WW2結(jié)構(gòu)域和在YAP結(jié)合結(jié)構(gòu)域中存在蛋白片段插入，野桑蠶Sd蛋白缺失了核定位信號(hào)基序和脯氨酸富集基序之間的鉸鏈區(qū)。Yki和Sd可按照物種科屬分別聚類，野桑蠶與家蠶聚為一支，表明這些同源蛋白在功能相似的同時(shí)，也具有基于物種的功能特異性。本研究為深入研究野桑蠶Hippo通路的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：野桑蠶（Bombyx mandarina）;Hippo通路;聚類分析

Abstract： The Hippo signaling pathway plays a key role in animal growth and development.According to the known sequences， we used BLAST software to identify the sequence of Hippo pathway component gene in the transcriptome of wild silkworm （Bombyx Mandarina）.? The protein molecular weight， isoelectric point， secondary structure， conserved domain and conserved element were also prospected and analyzed by ORFinder， web CD-search tool， Expasy-protparam， EMBL-EBI and MEME bioinformatics tools. The homologous sequence alignment and phylogeny were analyzed by Clustalx and MEGA 6.0 software. The homologous genes of salvador， warts， mats， yorkie and scalloped were identified in wild silkworm， and ORF frame and coding protein were predicted. The result showed that，Warts， Sav and Mats of wild silkworm shared up than 98% similarity with that of domestic silkworm， while Yki and Scalloped shared 89.02% and 79.13%? identity respectively between wild and domestic silkworm. The WW2 domain of BmYKi were deleted， and one peptide were inserted in YAP-binding domain of BmSd， while Sd of wild silkworm missing the hinge region between nuclear localization signal motif and proline-rich motif. Yki and Sd could be clustered into subgroup according to species， families and genera， wild and domestic silkworm were clustered into the same branch，suggesting that the homologous proteins could play species-based functional specificity as well as functional conservation. This study could provide a theoretical basis for further study on the mechanism of Hippo pathway in wild silkworm.

Key words： wild silkworm （Bombyx mandarina）; Hippo pathway; cluster analysis

野桑蠶（Bombyx mandarina）是家蠶（Bombyx mori）的祖先種，是培育家蠶優(yōu)良種的重要素材資源[1-3]。生物器官尺寸調(diào)控是生命科學(xué)領(lǐng)域基于科學(xué)的問(wèn)題之一，對(duì)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物而言，器官的尺寸是產(chǎn)量或質(zhì)量的重要因素，如家蠶絲腺等。Hippo通路是一條存在于多細(xì)胞生物中且進(jìn)化上高度保守的生長(zhǎng)信號(hào)調(diào)控途徑，是發(fā)育生物學(xué)及腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域的前沿和熱點(diǎn)話題，該通路不僅在調(diào)控器官尺寸大小方面起到關(guān)鍵作用，還參與干細(xì)胞自我更新[4]、組織再生、腫瘤發(fā)生和能量代謝[5，6]等生理生化過(guò)程。Hippo通路是一條在多細(xì)胞動(dòng)物中普遍存在且高度保守的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最早是在果蠅腫瘤抑制基因的遺傳學(xué)篩選中被發(fā)現(xiàn)并逐步建立起來(lái)的。其核心部分是一個(gè)磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑，核心成員包括Ste20樣蛋白激酶Hpo（Hippo）[7-9]、支架蛋白Sav（Salvador）[10]、NDR家族蛋白激酶Wts（Warts）[11]、腫瘤抑制蛋白Mats（Mob as tumor suppressor）[12]組成，而下游的轉(zhuǎn)錄激活因子Yki（Yorkie）[13]和介導(dǎo)Yki在特定DNA序列上結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子TEAD/TEF家族的Sd（Scalloped）將通路信號(hào)傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[14-16]。

在家蠶中，20余個(gè)Hippo通路相關(guān)基因獲得鑒定，部分基因獲得克隆和功能研究[17-21]。Li等[22]鑒定了家蠶Hippo通路相關(guān)蛋白，分析了相關(guān)基因在家蠶各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式，在家蠶細(xì)胞系中的上調(diào)、下調(diào)hpo和yki基因表達(dá)表明Hippo通路在家蠶發(fā)育及細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程中起到重要作用;Xu等[23]發(fā)現(xiàn)敲除家蠶Hippo基因可導(dǎo)致家蠶體形縮小，發(fā)育和軀體著色異常，且幼蟲(chóng)致死;齊海生[24]發(fā)現(xiàn)下調(diào)Bmhpo、Bmyki基因表達(dá)可導(dǎo)致家蠶前翅原基顯著縮小;錢瑩[25]在家蠶卵巢細(xì)胞中分別表達(dá)過(guò)Bmyki及其磷酸化位點(diǎn)突變體BmYkiS97A，細(xì)胞體積分別增大23%和27%，分裂期細(xì)胞數(shù)量分別增加14.7%和10.0%，而抑制Bmyki則使細(xì)胞體積縮小。野桑蠶中的Hippo通路尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。

馴化使家蠶和野桑蠶在體形、器官尺寸和發(fā)育模式等許多方面均表現(xiàn)出顯著差異。比較家蠶和野桑蠶的表型差異，發(fā)掘相關(guān)的分子機(jī)制，將為家蠶種質(zhì)的遺傳改良提供分子靶標(biāo)和基因資源。鑒于Hippo通路在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育中的重要作用，本研究利用獲得的野桑蠶全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，在野桑蠶中鑒定Hippo通路關(guān)鍵基因，比較家蠶和野桑蠶之間的差異，探討基因的親緣關(guān)系，將有助于了解家蠶在馴化過(guò)程中種質(zhì)變化的內(nèi)在分子機(jī)制，為野桑蠶基因資源的發(fā)掘利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于鑒定野桑蠶Hippo通路關(guān)鍵基因數(shù)據(jù)來(lái)源于前期研究的轉(zhuǎn)錄組基因集數(shù)據(jù)（未發(fā)表）。

1.2 序列比對(duì)和基因鑒定

由于家蠶與野桑蠶的親緣關(guān)系很近，利用家蠶Hippo通路相關(guān)蛋白序列作為查詢（Query）序列，通過(guò)本地 BLASTP 和 TBLASTN 程序比對(duì)野桑蠶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，獲得野桑蠶Hippo通路關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄本序列。家蠶和其他物種的同源基因與編碼蛋白序列均從GenBank（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得。利用ORFinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄本的編碼序列和氨基酸序列。所有序列均通過(guò)NCBI在線工具BLASTP予以核實(shí)。

1.3 結(jié)構(gòu)域分析

利用Web CD-search tool（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/）預(yù)測(cè)編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。利用在線工具ExPASY（http：//wed.expasy.org/compute_pi）分析蛋白理化性質(zhì)。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用Clustalx軟件進(jìn)行核酸序列的同源性比對(duì)和相似性分析;采用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，構(gòu)建方法為鄰接法（Neighbor-joining），參數(shù)設(shè)置為Bootstrap=1 000，Poisson model，gaps/missing處理方式為pairwise deletion。

2 結(jié)果與分析

2.1 野桑蠶Hippo通路關(guān)鍵基因的同源鑒定

通過(guò)序列比對(duì)和同源鑒定，在野桑蠶轉(zhuǎn)錄本中獲得了salvador（sav）、warts（wts）、mats、yorkie（yki）和scalloped的核酸序列，并預(yù)測(cè)ORF框和編碼蛋白。結(jié)果表明，野桑蠶sav開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 209 bp，編碼402個(gè)氨基酸，與家蠶同源基因一致性為99.50%;warts開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為3 078 bp，編碼? ? ?1 025個(gè)氨基酸，同家蠶同源基因一致性為100.00%;mats開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為654 bp，編碼蛋白包括217個(gè)氨基酸殘基，與家蠶同源基因一致性為98.84%;yki開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 314 bp，編碼437個(gè)氨基酸，與家蠶同源基因一致性為89.02%;scalloped基因開(kāi)發(fā)閱讀框?yàn)? 239 bp，編碼蛋白包含412個(gè)氨基酸殘基，與家蠶同源基因一致性為79.13%（表1）。各蛋白的親水性平均系數(shù)均小于0，表明均為親水性蛋白。在野桑蠶轉(zhuǎn)錄本中未拼接得到hpo同源基因。

結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析表明，野桑蠶和家蠶Warts、Mats、Salvador蛋白結(jié)構(gòu)域組成和排布均完全一致，其中野桑蠶Warts含有保守的STKc結(jié)構(gòu)域、UBA結(jié)構(gòu)域和Retinal超家族基序;SAV蛋白近C末端含有2個(gè)WW結(jié)構(gòu)域;Mats蛋白含有Mob1 phocein結(jié)構(gòu)域（圖1）。兩者在Yki和Scalloped蛋白序列上表現(xiàn)出顯著差異。野桑蠶Yki蛋白存在2個(gè)WW結(jié)構(gòu)域，而家蠶中僅存1個(gè);野桑蠶Scalloped蛋白C端顯著短于家蠶（圖1）。

2.2 表達(dá)分析

利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了野桑蠶Hippo通路相關(guān)基因在蛹滯育過(guò)程中的表達(dá)模式。結(jié)果如圖2所示，warts和yki在蛹滯育各時(shí)期均處于高表達(dá)，sd、sav和mob表達(dá)水平相對(duì)較低，而hpo則接近無(wú)表達(dá)。

2.3 YAP和Scalloped的序列比較

YAP同源蛋白在不同物種間具有高度的保守性，人源YAP蛋白（XP_005271435.1）中的保守基序/結(jié)構(gòu)域及其位點(diǎn)如圖3所示，由N端至C端依次包括TEAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域（53～112）、14-3-3結(jié)合位點(diǎn)（122～133）、WW1結(jié)構(gòu)域（174～204）、WW2結(jié)構(gòu)域（233～261）、SH3結(jié)合位點(diǎn)（280～292）、C2結(jié)構(gòu)域（307～359）和PDZ結(jié)合位點(diǎn)（506～510）等。以此為參考，不同物種的Yki同源蛋白中均鑒定得到與人源YAP蛋白中對(duì)應(yīng)的等結(jié)構(gòu)域或基序，其中TEAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域、14-3-3結(jié)合位點(diǎn)、WW1結(jié)構(gòu)域和PDZ結(jié)合位點(diǎn)在不同物種間高度保守，而WW2結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)合位點(diǎn)和C2結(jié)構(gòu)域及各結(jié)構(gòu)域之間的鉸鏈區(qū)相似性相對(duì)較低，主要表現(xiàn)為相比于哺乳動(dòng)物，昆蟲(chóng)同源蛋白在該區(qū)域存在不同程度的序列缺失。家蠶和野桑蠶的序列差異主要體現(xiàn)在家蠶Yki蛋白缺失了靠近C末端的WW2結(jié)構(gòu)域（圖3）。

人源TEAD1蛋白序列（UniProt P28347），其保守基序、結(jié)構(gòu)域及位點(diǎn)如圖3所示，由N端至C端依次包括TEA 結(jié)構(gòu)域（30～87）、核定位信號(hào)位點(diǎn)（88～103）、脯氨酸富集基序（143～204）、YAP結(jié)合結(jié)構(gòu)域（205～426）和絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸富集基序（306～328）。以此為參照，在不同物種的TEAD蛋白中均鑒定得到N端的TEA結(jié)構(gòu)域和C端的YBD結(jié)構(gòu)域以及核定位信號(hào)位點(diǎn)、脯氨酸富集基序、絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸富集基序等保守基序，這些結(jié)構(gòu)域和基序在不同物種之間表現(xiàn)出高度的一致性，蛋白N端和結(jié)構(gòu)域鉸鏈區(qū)相似性相對(duì)較低，其中黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）和野桑蠶在核定位信號(hào)位點(diǎn)與脯氨酸富集基序的鉸鏈區(qū)存在較大片段缺失。比較家蠶和野桑蠶可發(fā)現(xiàn)，野桑蠶Sd蛋白缺失了核定位信號(hào)基序和脯氨酸富集基序之間的鉸鏈區(qū)，而家蠶Sd蛋白的YAP結(jié)合結(jié)構(gòu)域中存在蛋白片段插入（圖4）。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

在脊椎動(dòng)物中，TAZ是YAP的同源蛋白。進(jìn)化分析顯示，脊椎動(dòng)物和昆蟲(chóng)的YAP同源蛋白各自聚類。在脊椎動(dòng)物中，TAZ和YAP又分別聚為亞群。在昆蟲(chóng)中，鱗翅目和膜翅目分別聚類，野桑蠶與家蠶的距離最為接近，雙翅目昆蟲(chóng)表現(xiàn)出明顯的多樣性（圖5）。

脊椎動(dòng)物中共存在4種TEAD同源蛋白（TEF1、TEF3、TEF4和TEF5），而昆蟲(chóng)中僅存在一種，即Scalloped。聚類分析顯示，脊椎動(dòng)物中TEAD共同聚為1類，然后TEF1、TEF3、TEF4和TEF5等蛋白各自聚類為亞群;昆蟲(chóng)Scalloped蛋白聚為另1大類群，其下再以物種科屬聚類成為亞群。在昆蟲(chóng)中，鱗翅目昆蟲(chóng)聚為1支，其中家蠶與野桑蠶距離最為接近，家蠶支顯著長(zhǎng)于野桑蠶，表明家蠶和野桑蠶親緣性最為接近，同時(shí)該基因在家蠶進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷較多的選擇過(guò)程（圖6）。

3 小結(jié)與討論

野桑蠶是家蠶的祖先種，比較野桑蠶和家蠶功能基因差異，有利于發(fā)掘野桑蠶基因資源，對(duì)于蠶桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。Hippo通路是一條由一系列蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子組成的激酶鏈，與許多調(diào)控途徑相結(jié)合，形成一個(gè)交互影響的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。在本研究中，根據(jù)同源比對(duì)，在野桑蠶中鑒定了Hippo通路salvador、warts、mats、yorkie和scalloped 5個(gè)核心元件編碼序列，其中mats、sav和warts與家蠶同源基因的序列一致性在98%以上;野桑蠶yki和scalloped與家蠶同源序列的一致性分別為89.02%和79.13%。結(jié)構(gòu)域分析表明，野桑蠶Mats、Sav和Warts和家蠶Hippo的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成一致，而家蠶Yki蛋白缺失了靠近C末端的WW2結(jié)構(gòu)域，家蠶Sd蛋白YAP結(jié)合域中存在蛋白片段插入，野桑蠶Sd蛋白缺失了核定位信號(hào)基序和脯氨酸富集基序之間的鉸鏈區(qū)。結(jié)果顯示，野桑蠶Hippo通路核心基因的功能及磷酸級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑與其他昆蟲(chóng)相似，而該通路的末端作用因子Yki、Scalloped等功能及作用方式在家蠶和野桑蠶之間可能存在差異，由此是否影響對(duì)靶基因的調(diào)控，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)育特征的顯著差異，值得深入探討。

在Yki和Sd同源蛋白的分子聚類上，脊椎動(dòng)物和昆蟲(chóng)分別聚為兩大類群，其下再按照物種科屬分別聚類，暗示蛋白功能上的趨同，同時(shí)也有物種的特異化。盡管在序列上存在一定差異，野桑蠶仍然與家蠶聚為一支，暗示基因功能在兩者之間存在相似性。本研究為深入開(kāi)展野桑蠶Hippo通路與特殊種質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)研究奠定了基礎(chǔ)。

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