環(huán)維黃楊星D對H2O2損傷大鼠心房肌細(xì)胞L型鈣通道的影響*

王增夏， 關(guān)懷敏， 王賀， 邱承杰， 趙亞楠， 曹英杰， 解金紅△

1河南中醫(yī)藥大學(xué)(河南鄭州 450046)；河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 2心臟中心, 3藥劑科(河南鄭州 450000)

環(huán)維黃楊星D(cyclovirobuxine D)是從黃楊木中提取的單體成分，臨床驗(yàn)證具有祛風(fēng)除濕、行氣活血之功效。較多的臨床觀察發(fā)現(xiàn)環(huán)維黃楊星D具有抗心律失常的作用[1]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)環(huán)維黃楊星D可以抑制L型鈣電流(ICaL)[2]。環(huán)維黃楊星D還具有抗氧化應(yīng)激的作用。最近研究顯示氧化應(yīng)激、心房電重構(gòu)與房顫的發(fā)生有關(guān)[3]，L型鈣通道[4]是心臟電活動中重要的離子通道之一，ICaL是動作電位二期平臺期的重要離子流。心臟的電重構(gòu)可能與活性氧自由基(ROS)的過量產(chǎn)生有關(guān)，在心肌組織中，超氧化物、過氧化氫(H2O2)可以導(dǎo)致ROS水平的增加。研究表明H2O2可以用來建立細(xì)胞的氧化損傷模型[5]。藥物通過影響離子通道可以起到對抗或?qū)е滦穆墒С５淖饔?。膜片鉗技術(shù)可直接測定膜離子通道電流的大小和細(xì)胞膜電位[6]，是研究藥物對離子通道活性影響的最為直接的手段。抗心律失常藥物在臨床上往往有致心律失常的作用，而環(huán)維黃楊星D有關(guān)致心律失常的作用報(bào)道較少，這體現(xiàn)了中藥具有多靶點(diǎn)、不良反應(yīng)小等優(yōu)勢。2017年5月至2018年12月,本實(shí)驗(yàn)研究在于明確H2O2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激及環(huán)維黃楊星D對大鼠心房肌細(xì)胞L型鈣通道電生理特性的影響，為中藥環(huán)維黃楊星D治療房顫提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取清潔級成年健康雄性SD大鼠(購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)36只，體重280～320 g，動物合格證編碼:SYXK(豫)2017-0001；本實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)通過河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的審查，實(shí)驗(yàn)動物倫理審查批準(zhǔn)編號：YFYDW2017004。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 10 mol/L H2O2、二甲基亞砜(DMSO)、TEA-Cl購于美國Sigma公司，膠原酶Ⅱ購于Gibco公司， HEPES、NaH2PO4、L-谷氨酸(L-Glutamic Acid)、EGTA、牛磺酸(Taurine)、CsCl、Mg-ATP購于北京索萊寶科技有限公司；CaCl2購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，環(huán)維黃楊星D購于上海源葉生物科技有限公司；其余試劑均來源于國產(chǎn)分析純。

1.3 溶液成分

1.3.1 無鈣臺式液成分 NaCl 136 mmol/L、MgCl2·6H2O 1 mmol/L、KCl 5.4 mmol/L、Glucose 10 mmol/L、NaH2PO4·2H2O 0.33 mmol/L、HEPES 10 mmol/L；用NaOH將pH值調(diào)至7.4。

1.3.2 KB液成分 KOH 80 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、KCl 30 mmol/L、MgCl2·6H2O 1 mmol/L、Taurine 20 mmol/L、Glucose 10 mmol/L、L-Glutamic Acid 50 mmol/L、KH2PO420 mmol/L、EGTA 0.5 mmol/L。用KOH將pH值調(diào)至7.4。

1.3.3 酶液 20 mgⅡ型膠原酶、10 μL 0.1 mol/L CaCl2加入到無鈣臺式液中，定容至50 mL。

1.3.4 記錄ICaL的細(xì)胞內(nèi)液成分 CsCl 130 mmol/L、Mg-ATP 3 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、EGTA 15 mmol/L、MgCl2·6H2O 2 mmol/L、Glucose 10 mmol/L。用CsOH將pH值調(diào)至7.2。

1.3.5 記錄ICaL的細(xì)胞外液成分 CaCl22 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、MgCl2·6H2O 1 mmol/L、TEA-Cl 136 mmol/L、Glucose 10 mmol/L。用CsOH將pH值調(diào)至7.4。

1.4 方法

1.4.1 成年SD大鼠單個心房肌細(xì)胞的分離 采用酶解法分離心房肌獲得單個心房肌細(xì)胞[7]：將無鈣臺式液、KB液、酶液100%O2提前充氧30 min，將恒溫水浴箱溫度調(diào)至42℃使出口溫度在37.5℃左右，調(diào)節(jié)蠕動泵使灌流速度為5.4 mL/min。SD大鼠麻醉前先腹腔注射肝素(200 IU/mL)0.3 mL，后給予10%水合氯醛(0.30 mg/kg)腹腔注射麻醉。麻醉后從劍突下剪開皮膚，開胸，迅速取出心臟，放入冰無鈣臺式液培養(yǎng)皿里，移至灌流裝置處，用無齒眼科鑷夾住主動脈上緣，逆行插管至主動脈根部，使插管的下緣與肺動脈的起始端水平。使用Langendorff恒流灌流裝置[8]，在恒溫狀態(tài)下(溫度保持在37.5℃)，用無鈣臺式液灌流2～3 min，心臟內(nèi)殘血排出干凈后，換用酶液繼續(xù)灌流2 min使臺式液沖洗干凈，后結(jié)扎肺靜脈、肺動脈及上下腔靜脈，繼續(xù)酶液循環(huán)灌流約10 min，心臟有暗紅色變成粉紅時(shí)，用眼科鑷輕輕牽拉心房肌，待心房肌組織變得松軟，牽拉基本無阻力時(shí)，立刻沿房室間溝剪取左右心房，放置于KB液中，用眼科剪將心房肌組織剪碎成約1 mm3的組織塊，用吸管輕柔緩慢規(guī)律吹打組織塊3～5 min，當(dāng)組織塊被吹打成細(xì)絲絮狀時(shí)，即可獲得單個心房肌細(xì)胞，將含有心房肌細(xì)胞的KB液用200目的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，用小燒杯將過濾后的細(xì)胞懸液定容至10 mL，準(zhǔn)備細(xì)胞復(fù)鈣。用含有相應(yīng)CaCl2濃度的KB液，依次逐步加入到10 mL細(xì)胞懸液中，使細(xì)胞懸液恢復(fù)至生理濃度，具體復(fù)鈣步驟如下：第一次：2 mL KB液+12 μL 0.1 mol/L CaCl2吹打混勻后緩慢加到10 mL細(xì)胞懸液中；每隔5 min，用相同方法依次加入16、35、79、94 μL 0.1 mol/L CaCl2于2 mL KB液中，混勻后加入到細(xì)胞懸液中。復(fù)鈣結(jié)束后用細(xì)胞懸液在放有細(xì)胞爬片的細(xì)胞培養(yǎng)板里鋪板，給予相應(yīng)的藥物干預(yù)后，置于37℃，5% CO2孵箱中孵育，以備后續(xù)膜片鉗實(shí)驗(yàn)使用。

1.4.2 藥物配制 環(huán)維黃楊星D用無水酒精溶解(無水酒精的終濃度不超過0.1%)，加KB液制備成母液，敷藥時(shí)稀釋成20 μmol/L的工作液。10 mol/L H2O2[9]敷藥時(shí)稀釋成100 μmol/L工作液。

1.4.3 心房肌細(xì)胞的處理和藥物的使用 細(xì)胞分為3組(n為細(xì)胞數(shù))：(1)對照組(n=8)：細(xì)胞不經(jīng)過任何處理直接進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)，記錄ICaL；(2)H2O2組(n=8)：細(xì)胞經(jīng)100 μmol/L的H2O2培養(yǎng)0.5 h后進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)并記錄ICaL；(3)環(huán)維黃楊星D組(n=9)：細(xì)胞預(yù)先經(jīng)100 μmol/L H2O2培養(yǎng)0.5 h后加入20 μmol/L環(huán)維環(huán)維黃楊星D培養(yǎng)0.5 h進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)并記錄ICaL。

1.4.4 排除電流干擾 為確保記錄的ICaL是純凈，故在細(xì)胞外液、電極內(nèi)液里均不加入Na+，以此排除Na+電流干擾，在上述兩種液體里分別加入TEA-Cl、CsCl 以此排除K+電流干擾。

1.4.5 刺激程序參數(shù) (1)L型鈣通道I-V曲線：鉗制電壓-70 mV，給予階躍10 mV，-60 mV～+60 mV，250 ms的系列刺激；(2)L型鈣通道失活曲線：鉗制電位-70 mV，給予階躍10 mV，-60 mV～+40 mV，1 000 ms的系列脈沖刺激，每一個條件脈沖后再緊跟+10 mV，250 ms的測試脈沖；(3)L型鈣通道恢復(fù)曲線：鉗制電位-70 mV，給予+10 mV，250 ms的刺激，間隔時(shí)間8、12、18、26、39、58、87、130、195、293、439、658、986、1 479 ms，再給予+10 mV，250 ms的刺激。

1.4.6 膜片鉗全細(xì)胞記錄模式 保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境安靜整潔，購買進(jìn)口玻璃電極(美國Sutter公司)，用P-97微電極拉制儀(Sutter公司)采用五步法拉制成電阻為2.0～5.0 MΩ的電極[10]，提前將制備好玻璃微電極放入自制盒里備用，使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)[11]，在電壓鉗制下記錄ICaL。將HEKA EPC-10放大器(德國)與計(jì)算機(jī)相連接。軟件PatchMaster控制電壓輸入信號和刺激信號的采集。在倒置顯微鏡下挑選細(xì)胞膜完整規(guī)則，邊界清晰，立體感強(qiáng)，表面光滑無顆粒，橫紋清楚，不自主收縮的梭形細(xì)胞。從玻璃電極尾部反向充灌好電極內(nèi)液，在玻璃電極進(jìn)入浴液之前前，給予輕微正壓，調(diào)節(jié)三維操縱儀(MP-225，Sutter公司)移動玻璃電極，使電極尖端入液，入液后進(jìn)行液接電位補(bǔ)償，繼續(xù)移動電極尖端的使其與細(xì)胞表面剛剛接觸，輕壓細(xì)胞，撤去正壓，再給予小的負(fù)壓，使電極尖端與細(xì)胞膜之間形成高阻封接，待封接電阻達(dá)到2 GΩ以上，進(jìn)行電極電容補(bǔ)償，脈沖式給予負(fù)壓，使細(xì)胞膜破膜形成全細(xì)胞記錄模式，補(bǔ)償全細(xì)胞膜電容。信號經(jīng)四階貝塞爾低通濾波器濾波，截止頻率為1 kHz，采用頻率為10 kHz。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心房肌細(xì)胞ICaL密度及I-V曲線變化的比較 與對照組相比，H2O2組ICaL密度升高[(-4.49±0.59) pA/pFvs(-7.47±0.68) pA/pF]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與H2O2組相比，環(huán)維黃楊星D組ICaL密度降低[(-7.47±0.68)pA/pFvs(-4.95±0.48)pA/pF]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：A:對照組原始電流圖;B:H2O2組原始電流圖;C：環(huán)維黃楊星D組原始電流圖; D：各組L型鈣通道的I-V曲線；E：各組L型鈣通道峰值電流的柱狀圖的比較；*與H2O2組比較 P<0.05

2.2 各組大鼠心房肌細(xì)胞L型鈣通道穩(wěn)態(tài)激活曲線變化的比較 記錄各組L型鈣通道的激活曲線，按照電流/電流最大值(I/Imax)=1-1/{1+exp[(Vx-V1/2)/k]} 公式進(jìn)行擬合，式中Vx為不同的去極化脈沖電壓，V1/2為通道激活50%時(shí)的脈沖電壓，k為斜率因子，計(jì)算出各組的激活的V1/2和k值。與對照組比較，H2O2組L型鈣通道穩(wěn)態(tài)激活曲線左移，半激活電壓V1/2從(-11.22±0.78)mV移動到(-13.83±0.99)mV，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與H2O2組比較，環(huán)維黃楊星D組L型鈣通道穩(wěn)態(tài)激活曲線向左移動，半激活電壓V1/2從(-13.83±0.99)mV移動到(-15.94±0.95)mV，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：A：各組擬合的L型鈣通道的激活曲線；B：L型鈣通道激活曲線的刺激程序；C：各組L型鈣通道激活的V1/2比較的柱狀圖，*與對照組比較 P<0.05；D：各組L型鈣通道激活的k值比較的柱狀圖

2.3 各組大鼠心房肌細(xì)胞L型鈣通道穩(wěn)態(tài)失活曲線變化的比較 記錄各組L型鈣通道的失活曲線，按照I/Imax=1/{1+exp[(Vx-V1/2)/k]}公式進(jìn)行擬合，式中，Vx為不同的條件脈沖電壓，V1/2為通道失活50%時(shí)的條件脈沖電壓，k為斜率因子，計(jì)算出各組的失活的V1/2和k值。與對照組相比，H2O2組L型鈣通道穩(wěn)態(tài)失活曲線變化不明顯，半失活電壓V1/2從(-29.44±0.81)mV移動到(-29.07±1.12)mV(P>0.05)；與H2O2組相比，環(huán)維黃楊星D組L型鈣通道穩(wěn)態(tài)失活曲線變化不明顯，半失活電壓V1/2從(-29.07±1.12)mV移動到(-30.48±0.70)mV，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果顯示H2O2、環(huán)維黃楊星D對L型鈣通道的失活影響無顯著性差異。見圖3。

注：A：各組擬合的L型鈣通道的失活曲線，B： L型鈣通道失活曲線的刺激程序；C：各組L型鈣通道失活的V1/2比較的柱狀圖；D：各組L型鈣通道失活的k值比較的柱狀圖

2.4 各組大鼠心房肌細(xì)胞L型鈣通道失活后恢復(fù)曲線變化的比較 記錄各組L型鈣通道的恢復(fù)曲線，按照I/Imax=1-exp(-t/τ)公式進(jìn)行擬合，式中，t為恢復(fù)時(shí)間常數(shù)，τ為通道恢復(fù)的時(shí)間常數(shù)，計(jì)算出各組失活后恢復(fù)的時(shí)間常數(shù)Tau值。與對照組相比，H2O2組失活后恢復(fù)曲線左移，L型鈣通道恢復(fù)時(shí)間常數(shù)Tau值從(0.18±0.02)s減少至(0.13±0.01)s，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與H2O2組相比，環(huán)維黃楊星D組恢復(fù)曲線右移，L型鈣通道恢復(fù)時(shí)間常數(shù)Tau值從(0.13±0.01)s增加至(0.15±0.02)s，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果顯示H2O2、環(huán)維黃楊星D對L型鈣通道的失活后恢復(fù)影響無顯著性差異。見圖4。

注：A：各組擬合的L型鈣通道失活后恢復(fù)的曲線，B：L型鈣通道失活后恢復(fù)曲線的刺激程序；C：各組L型鈣通道的失活后恢復(fù)時(shí)間常數(shù)Tau值比較的柱狀圖

3 討論

研究表明[12],Ca2+處理不當(dāng)是一個重要的致心律失常因素，也是房顫產(chǎn)生局灶性異位活動的機(jī)制之一；鈣循環(huán)異常是心律失常發(fā)生的誘因，可以導(dǎo)致早期后除極、晚期后除極和觸發(fā)活動[13]。氧化應(yīng)激是機(jī)體在遭受有害刺激時(shí)，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，體內(nèi)ROS產(chǎn)生過多導(dǎo)致組織損傷。外源性H2O2可以使ROS產(chǎn)生增多，ICaL增大，100 μmol/L H2O2可以使在HEK 293細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的L型鈣通道電流增大[14]。本實(shí)驗(yàn)采用H2O2制備氧化應(yīng)激模型，氧化應(yīng)激不但可以導(dǎo)致心房重構(gòu)，也可使心房電生理特性發(fā)生改變；心房電重構(gòu)、炎性因子增加、氧化損傷均可能與氧自由基增加有關(guān)。氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)ROS產(chǎn)生增加，進(jìn)而促使心臟重構(gòu)的發(fā)生[15]。

中藥黃楊木首見于《本草綱目》，歸心、肝、腎經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕、行氣活血之功。研究表明環(huán)維黃楊星D對氧化損傷的心肌有明顯的保護(hù)作用，有清除氧自由基的作用[16]。環(huán)維黃楊星D可明顯增加因缺氧或氧化損傷心肌細(xì)胞的存活率[17]。環(huán)維黃楊星D可增加冠脈血流量，提高心肌氧利用率，還有正性肌力作用，研究表明環(huán)維黃楊星D可以延長心房動作電位時(shí)程和有效不應(yīng)期[18]。環(huán)維黃楊星D具有抗心律失常、抗心肌缺血以及正性肌力的作用，因此對心血管疾病有很好的療效[19]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)環(huán)維黃楊星D可使H2O2預(yù)處理的心房肌細(xì)胞ICaL密度降低，但環(huán)維黃楊星D對L型鈣通道的激活、失活、恢復(fù)曲線的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，環(huán)維黃楊星D可能是通過降低ICaL來改善心房電重構(gòu)，環(huán)維黃楊星D對激活、失活、恢復(fù)曲線沒有影響，可能是通過改變鈣通道的數(shù)量來影響鈣電流的大小，其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。目前臨床上的抗心律失常藥物存在致心律失常的不良反應(yīng)，黃楊寧屬于Ⅲ類抗心律失常藥的范疇[20]。中藥環(huán)維黃楊星D的致心律失常作用很弱，且對伴有其他器質(zhì)性心臟病患者得治療有其特有的優(yōu)勢。因此，不良反應(yīng)少的環(huán)維黃楊星D藥物更適合臨床長期的應(yīng)用，本研究結(jié)果為環(huán)維黃楊星D的使用提供理論依據(jù)。