新綠原酸的大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的UPLC-Q-TOF MS鑒定△

李潔，劉子菡，董凡，王喻淇，王少平，代龍，張加余*，盧建秋

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.濱州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 煙臺 264003；3.北京中醫(yī)藥大學(xué) 圖書館，北京 100029

綠原酸(chlorogenic acids，CGAs)是天然抗氧化劑，也是藥食同源中藥中最豐富的多酚之一[1]。綠原酸類化學(xué)成分是眾所周知的抗菌消炎活性成分。此外，該類成分還具有保護DNA[2]、抗?jié)僛3]、降低膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白[4-5]等作用。其中，綠原酸(5-O-咖啡?？崴?是由咖啡酸與奎尼酸生成的縮酚酸[6]，又名咖啡鞣酸和咖啡單寧酸。由于咖啡?；c奎尼酸結(jié)合位點的不同，綠原酸還有新綠原酸(3-O-咖啡酰奎尼酸)和隱綠原酸(4-O-咖啡?？崴?等重要的同分異構(gòu)體。

綠原酸類在金銀花、菊花、茵陳、忍冬、杜仲等藥用植物中含量較高，并憑借顯著的抗炎效果成為《中華人民共和國藥典》中對中藥進行質(zhì)量控制的指標。然而，綠原酸在高溫、強光下不穩(wěn)定，在中性及堿性條件下容易水解為新綠原酸、隱綠原酸[7]。因此，異構(gòu)體之間的相互轉(zhuǎn)化直接影響到藥品質(zhì)量，從而影響到臨床療效。藥物進入人體后，吸收和代謝是藥物體內(nèi)代謝過程的重要步驟，與藥理活性密切相關(guān)。目前綠原酸的體內(nèi)代謝過程研究較為深入，但其位置異構(gòu)體新綠原酸的研究尚未開展，體內(nèi)代謝產(chǎn)物尚不明確。因此，新綠原酸的體內(nèi)代謝過程亟需進一步研究。

超高效液相色譜結(jié)合四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF MS)技術(shù)具有優(yōu)秀的色譜重現(xiàn)性以及超高的靈敏度和選擇性，可作為中藥復(fù)雜體系的快速分析平臺，并在代謝物鑒定中顯示出優(yōu)異的性能[8-10]。本文基于UPLC-Q-TOF MS篩選鑒定了新綠原酸的體內(nèi)代謝產(chǎn)物，并闡明其主要的體內(nèi)代謝通路，以期為綠原酸類成分的新藥研發(fā)及藥材、制劑的全面質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

Exion LCTMAC液相色譜儀與X500R QTOF質(zhì)譜，配有雙噴霧Turbo V離子源，SCIEX OS 1.3工作站(AB SCIEX公司)；R200D型電子分析天平(十萬分之一，德國Sartorius公司)；Millipore Synergy UV型超純水機(美國Millipore公司)；KQ-250 DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Eppendorf Centrifuge 5424 R離心機(德國);SPE Cartridges C18固相萃取小柱[500 mg·(3 mL)-1]。

新綠原酸(批號：PRF8050442)、隱綠原酸(批號：PRF8010501)、咖啡酸(批號：PRF7102044)、奎尼酸(批號：PRF8060823)均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，綠原酸(批號：110753-200413)、阿魏酸(批號：110773-201313)購于中國食品藥品檢定研究院，異阿魏酸(批號：MUST-14110611)購自成都曼思特生物科技有限公司，所有對照品純度均大于98%；乙腈和甲醇(質(zhì)譜級，美國Thermo Fisher 公司)；甲酸(色譜級，德國Merck公司)。

Sprague Dawley(SD)大鼠，雄性，體質(zhì)量(200±10) g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。

2 方法

2.1 對照品溶液的配制

分別取上述7種對照品適量，精密稱定，加入甲醇制成質(zhì)量濃度約100 μg·mL-1的儲備液，用時稀釋成質(zhì)量濃度適宜的對照品溶液。

2.2 生物樣品的制備

2.2.1對照品給藥液的配制 稱取新綠原酸180 mg，加入8 mL 0.9%氯化鈉溶液，超聲至充分混懸，配制成給藥溶液，于4 ℃儲存。

將8只SD大鼠隨機平均分為空白組和給藥組。實驗前，2組大鼠在動物房內(nèi)進行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周(室溫22～26 ℃，相對濕度40%～70%，12 h晝夜更替)，給藥前禁食12 h，全程不禁水。給藥組按200 mg·kg-1的劑量給予0.9%氯化鈉溶液混懸液，而空白組的每只大鼠灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液。各組均連續(xù)給藥2 d。

2.2.2血漿樣本的收集與儲存 大鼠在最后一次給藥后0.5、1、2、4 h，分別眼眶靜脈取血0.5 mL。所采集的血樣置于涂肝素鈉的離心管中靜置15 min，3500 r·min-1離心10 min(離心半徑為5.5 cm)，合并上述4個時間點的血液。分別吸取上清液，即得空白血漿和含藥血漿，于-80 ℃冰箱凍存。

2.2.3尿樣和糞樣的收集與儲存 灌胃給藥后0～24 h內(nèi)，每隔6 h收集1次尿液和糞便，分別合并。尿樣3500 r·min-1離心10 min，后取上清液于-80 ℃冰箱凍存。糞樣置于通風(fēng)櫥中晾干后碾碎，裝于離心管中凍存。

2.3 大鼠生物樣品的前處理

將2組凍存的血漿、尿液生物樣本放到室溫下解凍。取固相萃取柱，依次用3 mL甲醇和3 mL水對其進行活化，然后分別吸取生物樣品2 mL上樣，依次用3 mL水和3 mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液。

取各組糞樣適量，按照1∶5(W∶V)比例加入去離子水，超聲處理60 min，3500 r·min-1離心10 min，取上清液。取各組處理好的上清液置于固相萃取小柱，用3 mL水沖洗雜質(zhì)，最后用3 mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液。

將上述所有甲醇洗脫液，在室溫下用氮氣吹干，殘渣用100 μL的初始流動相復(fù)溶，渦旋振蕩3 min后，14 000 r·min-1離心15 min(離心半徑為5.5 cm)。取上清液進行分析。

2.4 液質(zhì)聯(lián)用分析條件

2.4.1色譜條件 色譜柱：Waters HSS T3 UPLC色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相：0.1%甲酸水溶液(B)和乙腈(A)，進樣室溫度：15 ℃，柱溫：40 ℃，洗脫梯度(0～6 min，2%～10%A；6～10 min，10%～25%A；10～15 min，25%～35%A；15～16 min，35%～40%A；16～20 min，40%～80%A；20～21 min，80%～95%A；21～24 min，95%A)，體積流量：0.3 mL·min-1，進樣量：5 μL。

2.4.2質(zhì)譜條件 HESI負離子模式，離子源溫度：550 ℃，電離源電壓：4.5 kV，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣(純度>99.99%)，掃描模式：Full MS/dd-MS2；數(shù)據(jù)依賴性ddMS2采集，F(xiàn)ull MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500，高分辨掃描范圍m/z100～1000，碰撞能為30 eV。

2.5 高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理

藥物的代謝產(chǎn)物通常具有相同或者相似的母核結(jié)構(gòu)?；诖?，可采用數(shù)據(jù)采集的質(zhì)量虧損過濾(MDF)軟件進行篩選追蹤主要的代謝物，尤其是不可預(yù)知的代謝產(chǎn)物。基于母藥新綠原酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)，設(shè)置了如下MDF模板：1)母藥(m/z353.086 71)及其核心結(jié)構(gòu)咖啡酸和奎寧酸(m/z179.035 02、m/z191.055 04)；2)GSH結(jié)合產(chǎn)物(m/z660.171 51)，糖基化產(chǎn)物(m/z515.140 43)，葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物(m/z529.119 90)和磺酸化產(chǎn)物(m/z433.043 53)等。另外，MDF窗口設(shè)置為±50 mDa。

所有數(shù)據(jù)采集和處理均在SCIEX OS 1.3.1工作站進行。根據(jù)精確分子質(zhì)量，元素組成和可能發(fā)生的反應(yīng)，對所有的母離子和碎片離子的分子式進行預(yù)測。相關(guān)參數(shù)設(shè)置為：C[0-30]，H[0-50]，O[0-30]，S[0-2]，N[0-3]，環(huán)不飽和雙鍵數(shù)(RDB equivalent value)[0-15]，質(zhì)量精度誤差在1×10-5以內(nèi)。

3 結(jié)果與討論

3.1 新綠原酸的質(zhì)譜裂解規(guī)律分析

對新綠原酸對照品在負離子模式下的碎片離子進行系統(tǒng)分析，總結(jié)得到相關(guān)的特征離子。在負離子模式下，新綠原酸的準分子離子峰為[M-H]-m/z353.087 40(1.83×10-6，C16H17O9)，在質(zhì)譜裂解過程中，其先丟掉1分子咖啡?；?，產(chǎn)生特征碎片離子m/z191.055 04(1.10×10-6，C7H11O6)，該離子繼續(xù)丟失1分子水產(chǎn)生m/z173.045 46(0.26×10-6，C9H7O4)。與此同時，還檢測到特征碎片咖啡酸離子m/z179.035 02，另外此離子分別丟失1分子水和1分子CO2形成碎片離子m/z161.022 4和m/z135.045 22。可能的裂解規(guī)律見圖1。

3.2 大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的分析鑒定

通過對給藥組生物樣品與空白組樣品的比較分析，結(jié)合在線MDF數(shù)據(jù)處理軟件對新綠原酸代謝產(chǎn)物進行相對準確地篩查、鑒定，最終在大鼠的尿液、血漿和糞便樣品中共篩選鑒定了43個代謝產(chǎn)物。其中在血、尿和糞中分別鑒定了20、30、11個，具體的質(zhì)譜信息見表1。代謝產(chǎn)物的鑒定結(jié)果分析如下。

圖1 負離子模式下新綠原酸對照品的質(zhì)譜裂解圖

表1 大鼠生物樣品中新綠原酸代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜信息

續(xù)表1

在負離子模式下，代謝物M10、M20、M17產(chǎn)生相同的準分子離子峰m/z353.086 71[M-H]-，推測其分子式為C16H17O9(誤差≤±2.00×10-6)。在其ESI-MS2譜圖中，它們均產(chǎn)生碎片離子m/z179.035 02(咖啡酸骨架離子)以及奎尼酸負離子碎片m/z191.055 04。其中，M10和M20的色譜保留時間與質(zhì)譜裂解信息與新綠原酸、綠原酸相同，因此將兩者分別準確鑒定為新綠原酸和綠原酸，并將M17推斷為其同分異構(gòu)體。

代謝物M39、M25、M26的相對保留時間分別為10.79、9.17、9.23 min。它們的準分子離子峰為m/z179.035 26[M-H]-，推斷最可能的分子式為C9H7O4(誤差≤±2.00×10-6)。在其ESI-MS2譜中，觀察到碎片離子m/z135[M-H-CO2]-，表明它們的分子中存在羧基。另外，根據(jù)與咖啡酸對照品的保留時間以及質(zhì)譜裂解行為比對，可將M25準確鑒定為咖啡酸，結(jié)合參考文獻[11]報道將M39和M26推斷為咖啡酸異構(gòu)體。

代謝物M9、M16具有相同的準分子離子峰m/z181.049 53[M-H]-，比咖啡酸多2。根據(jù)精確相對分子質(zhì)量推測其分子式為C9H9O4，相對誤差均小于2×10-6。在ESI-MS2譜中，m/z181丟失1分子H2O(18 Da)產(chǎn)生了主要的碎片離子m/z163，并且可中性丟失1分子CO2(44 Da)形成碎片離子m/z137。結(jié)合參考文獻[12]報道將兩者鑒定為咖啡酸的氫化產(chǎn)物。

M6的準分子離子峰為m/z236.057 07[M-H]-，可知其分子式為C11H10NO5，誤差為1.73×10-6。在其ESI-MS2譜圖中，m/z236通過中性丟失C2H4NO2和C3H4NO3，生成碎片離子m/z162[M-H-NH2CH2COO]-和m/z134[M-H-C2H4NO2-CO]-，由此推測分子中有甘氨酸和羰基的存在。參照文獻[13]報道，可將代謝產(chǎn)物M6鑒定為咖啡酸的甘氨酸結(jié)合產(chǎn)物。

代謝物M43在14.15 min被洗脫，其準分子離子峰為m/z357.078 55[M-H]-，推測其分子式為C15H17O10，誤差<2×10-6。在ESI-MS2譜圖中，m/z357通過中性丟失1分子CO2形成碎片離子m/z313。此外，還觀察到碎片離子m/z181[M-H-glucuronide-H2O]-，推測葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)發(fā)生。結(jié)合文獻[14]報道，M43被鑒定為二氫咖啡酸的葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。

代謝物M4在準分子離子峰在m/z147.045 43[M-H]-，推測其相對分子式為C9H7O2(誤差0.03×10-6)。在其ESI-MS2光譜中，m/z147通過中性丟失1分子CO2生成碎片離子m/z103[M-H-CO2]-。此外，它的相對分子質(zhì)量比咖啡酸少32 Da。結(jié)合文獻[15]報道以及相關(guān)的生物轉(zhuǎn)化規(guī)律，將M4鑒定為肉桂酸。

M28的準分子離子峰為m/z163.040 30[M-H]-，根據(jù)精確相對分子質(zhì)量推測其分子式為C9H7O3。M28的相對分子質(zhì)量比咖啡酸少16 Da，并產(chǎn)生碎片離子m/z119[M-H-CO2]-，表明有羧酸基團的存在。因此，將M28鑒定為咖啡酸的脫羥基產(chǎn)物香豆酸。

M8、M14、M11、M15有相同的準分子離子峰m/z261.006 35[M-H]-，推測其分子式為C9H9O7S，所有質(zhì)量誤差均小于2×10-6。在ESI-MS2譜圖中，由于中性損失1分子SO3和1分子CO2，分別產(chǎn)生碎片離子m/z181[M-H-SO3]-和m/z137[M-H-SO3-CO2]-，說明它們的分子結(jié)構(gòu)中存在羧基和磺酸基。結(jié)合相關(guān)文獻[14]報道，它們被鑒定為二氫咖啡酸磺酸化結(jié)合物。

代謝物M23的保留時間為9.08 min，準分子離子峰為m/z273.007 40[M-H]-，其分子式為C10H9O7S(質(zhì)量誤差0.20×10-6)。在ESI-MS2譜圖中，由于中性丟失SO3、CO2和CH3，分別產(chǎn)生碎片離子m/z193[M-H-SO3]-、m/z149[M-H-SO3-CO2]-和m/z134[M-H-SO3-CO2-CH3]-，表明分子結(jié)構(gòu)中存在羧酸基團、硫酸基團以及甲基?；谏鲜鐾普摵拖嚓P(guān)的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，M23被鑒定為甲基化咖啡酸的磺酸化產(chǎn)物。

M35的準分子離子峰為m/z135.044 06[M-H]-，保留時間為10.24 min。此外，分子式為C8H7O2(質(zhì)量誤差1.34×10-6)。在ESI-MS2圖譜中，由于中性丟失1分子CH3，從而觀察到二級碎片離子m/z120[M-H-CH3]-。根據(jù)相關(guān)的生物轉(zhuǎn)化規(guī)律，將M35鑒定為咖啡酸脫羧產(chǎn)物。

代謝物M19、M30、M41的保留時間為8.64、9.41、11.05 min，準分子離子峰為m/z193.049 53[M-H]-。根據(jù)精確相對分子質(zhì)量推測其分子式為C10H9O4(質(zhì)量誤差均在2.00×10-6以內(nèi))。在ESI-MS2圖譜中，由于中性丟失1分子CO2和1分子CH3產(chǎn)生碎片離子m/z178[M-H-CH3]-、m/z149[M-H-CO2]-和m/z134[M-H-CO2-CH3]-，表明分子中存在羧基和甲基。通過與對照品的質(zhì)譜碎片離子信息和色譜保留時間比較，M41被準確鑒定為阿魏酸，M30被準確鑒定為異阿魏酸，M19推斷為其同分異構(gòu)體。

M22、M38的色譜保留時間分別為9.01、10.72 min，準分子離子峰分別為m/z165.055 89和m/z165.055 85，根據(jù)精確相對分子量可知分子式組成為C9H9O4(誤差分別為1.29×10-6和1.25×10-6)。在ESI-MS2圖譜中，兩者均通過丟失1分子CO2在m/z121[M-H-CO2]-處形成產(chǎn)物離子，這表明其分子中存在羰基。根據(jù)先前報道的文獻[16]，M22和M38被鑒定為對羥基苯丙酸或其異構(gòu)體。

代謝物M1的準分子離子峰為m/z191.056 14[M-H]-，保留時間為0.93 min，分子式為C7H11O6(質(zhì)量誤差1.13×10-6)。在ESI-MS2圖譜中，通過中性丟失1分子水和1分子CO2產(chǎn)生碎片離子m/z173[M-H-H2O]-和m/z147[M-H-CO2]-。此外，中性丟失2分子水和1分子CO2產(chǎn)生碎片離子m/z111[M-H-CO2-2H2O]-。據(jù)此推斷分子中極有可能存在至少2個羥基和1個羧基。M1與奎尼酸對照品的色譜保留時間和質(zhì)譜碎片相同，因此結(jié)合參考文獻[17]將代謝物M1準確鑒定為為奎尼酸。

代謝物M2準分子離子峰為m/z173.045 72[M-H]-，基于精確分子質(zhì)量可知其分子式為C7H9O5(誤差≤±2.00×10-6)。其分子離子比奎尼酸少18 Da，推測它極有可能是奎尼酸的脫羥基產(chǎn)物。在ESI-MS2圖譜中，通過中性丟失1分子CO2產(chǎn)生碎片離子m/z129[M-H-CO2]-，另外中性丟失1分子H2O產(chǎn)生碎片離子m/z155[M-H-H2O]-，這表明分子中存在羥基和羧基。結(jié)合相關(guān)的文獻[11]報道，將代謝產(chǎn)物M2鑒定為莽草酸。

代謝物M27的準分子離子峰為m/z121.029 85[M-H]-，分子式為C7H5O2(誤差為1.45×10-6)。此外，它通過丟失1分子CO產(chǎn)生碎片離子m/z93[M-H-CO]-，這表明該化合物中存在羰基。根據(jù)先前報道的文獻[18]，代謝產(chǎn)物M27被鑒定為苯甲酸。

代謝物M12準分子離子峰為m/z137.024 59[M-H]-。分子式為C7H5O3(誤差為1.27×10-6)，其分子離子比苯甲酸多16 Da，推測可能是苯甲酸的羥基化產(chǎn)物。在ESI-MS2圖譜中，通過中性丟失1分子CO2和1分子H2O分別產(chǎn)生碎片離子m/z93[M-H-CO2]-和m/z109[M-H-H2O]-，表明該化合物中存在羥基和羰基。根據(jù)先前報道的文獻[19]，將代謝物M12鑒定為3-羥基苯甲酸。

代謝物M18準分子離子峰在m/z178.051 07[M-H]-，基于精確分子質(zhì)量、同位素豐度比可知其分子式為C9H8NO3(誤差1.21×10-6)。在ESI-MS2圖譜中，通過中性丟失1分子CO2產(chǎn)生二級碎片離子m/z134[M-H-CO2]-，這表明分子中有羧酸基團的存在。因此，將其鑒定為馬尿酸。

代謝物M13在7.77 min時洗脫，準分子離子峰為m/z194.046 43[M-H]-。其分子式為C8H8NO4(誤差1.63×10-6)。另外，它的分子離子比馬尿酸多16 Da。此外，通過中性丟失1分子CO2和1分子CH3生成碎片離子m/z135[M-H-CO2-CH3]-和m/z150[M-H-CO2]-，表明分子中存在羧基和甲基。因此，結(jié)合參考文獻[19]將其鑒定為3-羥基馬尿酸。

代謝物M3、M7色譜保留時間分別為4.7、6.15 min。它們的準分子離子峰為m/z197.044 45[M-H]-，分子式組成為C9H9O5(誤差≤±2.00×10-6)。在ESI-MS2圖譜中，通過丟失1分子OCH2、1分子H2O和1分子CO2生成碎片離子m/z167[M-H-OCH2]-，m/z149[M-OCH3-H2O]-和m/z121[M-OCH3-H2O-CO]-，表明分子中存在甲氧基、羰基以及羥基。結(jié)合相關(guān)的生物轉(zhuǎn)化知識，代謝物M3、M7鑒定為丁香酸或其異構(gòu)體。

代謝物M5色譜保留時間為5.33 min。在其ESI-MS譜圖中，準分子離子峰m/z167.034 97[M-H]-(分子式為C8H7O4，誤差1.09×10-6)。在其ESI-MS2譜圖中，通過中性丟失1分子CO2(44 Da)和1分子H2O(18 Da)產(chǎn)生碎片離子m/z123[M-H-CO2]-和m/z149[M-H-H2O]-，這表明分子中存在羧基和羥基。結(jié)合相關(guān)的文獻報道將其鑒定為香草酸。

在ESI-MS譜圖中，代謝物M40的準分子離子峰為m/z355.097 23[M-H]-(C16H19O9，誤差-5.13×10-6)，色譜保留時間為11.04 min。其分子式比原型藥物多2H，推測它是新綠原酸的氫化產(chǎn)物。除此之外，在其ESI-MS2譜圖中，觀察到二級碎片m/z173[奎尼酸-H2O-H]-和m/z181[二氫咖啡酸-H]-和m/z137[二氫咖啡酸-CO2-H]-。因此，代謝物M40鑒定為二氫新綠原酸。

在C17H19O9提取離子流圖中，可以檢測到4個準分子離子峰M21、M29、M34、M37(誤差均 ≤± 2.00×10-6)，色譜保留時間為8.92～10.42 min。它們分子式比原藥新綠原酸多CH2。在其ESI-MS2譜圖中，它們都具有相同的產(chǎn)物離子m/z134.045 22。此外，還存在碎片離子m/z191.055 04[奎尼酸-H]-和m/z173.045 72[奎寧酸-H2O-H]-。綜上分析，它們具有與原藥相同的特征離子并且比原藥分子離子多14 Da，因此將其鑒定為新綠原酸的甲基化產(chǎn)物。

M24、M31、M32、M33、M36有相同的準分子離子峰為m/z369.118 01[M-H]-(C17H21O9，誤差≤± 2.00×10-6)。它們分子式比原藥的甲基化產(chǎn)物多2 H。在其ESI-MS2光譜中，它們具有與原藥相同的特征離子m/z191[奎尼酸-H]-，m/z173[奎尼酸-H2O-H]-，據(jù)此推斷它們是甲基化綠原酸的氫化產(chǎn)物。

代謝物M42保留時間為13.82 min，準分子離子峰為m/z543.170 83[M-H]-(C24H31O14)。在其ESI-MS2譜圖中，通過丟失176 Da產(chǎn)生碎片離子m/z367[M-H-C7H12O5]-，這表明其分子中含有葡萄糖醛酸。且m/z367比原藥分子式多CH2，結(jié)合二級碎片離子m/z173[奎寧酸-H2O-H]-和m/z135[咖啡酸-CO2-H]-。表明有奎尼酸骨架、咖啡酸骨架存在。因此，M42被鑒定為甲基新綠原酸的葡萄糖結(jié)合產(chǎn)物。

3.3 大鼠體內(nèi)新綠原酸的代謝途徑分析

新綠原酸進入大鼠體內(nèi)后發(fā)生了廣泛的代謝反應(yīng)[20-22]。結(jié)合代謝產(chǎn)物分析新綠原酸在體內(nèi)的代謝過程及轉(zhuǎn)化，結(jié)果見圖2，其在體內(nèi)主要發(fā)生的反應(yīng)有3種。1)異構(gòu)化：在新綠原酸給藥后的生物樣品中發(fā)現(xiàn)了綠原酸和其異構(gòu)體，說明新綠原酸在體內(nèi)進行了位置異構(gòu)等反應(yīng)。2)分解反應(yīng)：新綠原酸進入體內(nèi)后可以水解為咖啡酸和奎尼酸2個核心代謝產(chǎn)物，并在此基礎(chǔ)上發(fā)生進一步的二次代謝反應(yīng)?？崴峤?jīng)體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化為莽草酸，經(jīng)2次脫羥基后生成羥基苯甲酸，再脫羥基變?yōu)楸郊姿?，?jīng)過與甘氨酸結(jié)合后生成馬尿酸，最后馬尿酸羥基化反應(yīng)生成3-羥基馬尿酸；奎尼酸也可以直接轉(zhuǎn)化為丁香酸，而后脫去甲氧基和羥基生成香草酸。而咖啡酸也發(fā)生多種反應(yīng)。例如，甲基化生成阿魏酸或異阿魏酸；還原反應(yīng)生成二氫咖啡，并在此基礎(chǔ)上進行硫酸酯化生成二氫咖啡酸硫酸酯結(jié)合物或者二氫咖啡酸葡萄糖醛酸化生成二氫咖啡酸葡萄糖醛酸結(jié)合物；咖啡酸還發(fā)生了分解反應(yīng)，比如脫羧反應(yīng)，再者脫羥基后生成香豆酸而后繼續(xù)脫羥基生成肉桂酸等。3)其他反應(yīng)：首先新綠原酸容易還原生成二氫新綠原酸；其次甲基化反應(yīng)，新綠原酸在咖啡酸側(cè)鏈上發(fā)生甲基化反應(yīng)；最后，新綠原酸能夠在側(cè)鏈上連接葡萄糖醛酸發(fā)生葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究利用UPLC-Q-TOF MS高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析鑒定了新綠原酸在大鼠的血漿、尿液和糞便樣品中的代謝產(chǎn)物。通過分析這些代謝產(chǎn)物的精確相對分子質(zhì)量、特征碎片離子以及色譜保留行為等，共篩選鑒定出包括新綠原酸原型在內(nèi)的43個代謝產(chǎn)物。同時，本研究還推測了新綠原酸的體內(nèi)代謝途徑，初步闡釋了其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)輪廓。新綠原酸的體內(nèi)代謝產(chǎn)物主要有咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、莽草酸、香草酸等，它們均具有很好的抗菌、抗氧化作用，這為闡明新綠原酸發(fā)揮抗菌、抗炎等藥理活性提供了一定依據(jù)。上述研究結(jié)果也為含有綠原酸類物質(zhì)的中藥及食品的體內(nèi)代謝研究提供了借鑒，尤其對藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究具有重要參考意義。

圖2 新綠原酸在大鼠體內(nèi)的代謝途徑