白菜型冬油菜溫敏不育系PK3-12S育性轉(zhuǎn)換的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析

米文博 方 園 劉自剛 徐春梅 劉高陽 鄒 婭 徐明霞 鄭國強 曹小東 方新玲

白菜型冬油菜溫敏不育系PK3-12S育性轉(zhuǎn)換的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析

米文博 方 園 劉自剛*徐春梅 劉高陽 鄒 婭 徐明霞 鄭國強 曹小東 方新玲

甘肅省干旱生境作物生物學(xué)重點實驗室 / 甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室 / 甘肅省油菜工程與技術(shù)研究中心 / 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 甘肅蘭州 730070

為揭示溫敏不育系PK3-12S育性轉(zhuǎn)換機制, 本研究以白菜型冬油菜溫敏不育系PK3-12花藥為材料, 采用2-DE和LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定等差異蛋白組學(xué)方法, 分離鑒定了PK3-12在不育/可育條件下花藥差異表達蛋白質(zhì), 并對差異表達蛋白進行了生物信息學(xué)分析; 進而采用RT-PCR檢測了PK3-12在不育/可育條件下花蕾發(fā)育進程中差異蛋白編碼基因表達量變化。結(jié)果表明, 高溫不育條件下, PK3-12花藥形態(tài)癟小, 藥室有少量敗育花粉, 育性轉(zhuǎn)換受1對隱性基因控制, 表達變化量在2倍以上差異蛋白質(zhì)點31個, 其中增量表達蛋白質(zhì)點6個, 減量表達蛋白質(zhì)點11個, 表達完全抑制蛋白點12個, 不育花藥特異表達蛋白點2個。質(zhì)譜鑒定出15個差異蛋白質(zhì), 參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、二羧基乙醛酸代謝、糖酵解代謝、次生合成代謝、氨基酸生物合成、分支酸生物合成、碳代謝途徑等細胞過程。Rubisco亞基連接蛋白編碼基因開放讀碼框(open reading frame, ORF)長度為1095 bp, 編碼364個氨基酸; 與可育花蕾相比, 發(fā)育進程中不育花蕾基因、膜聯(lián)蛋白基因()、BetVI過敏原家族基因()表達明顯下調(diào), 表明上述基因可能參與了溫敏不育系PK3-12S育性的轉(zhuǎn)換。

白菜型冬油菜; 溫敏不育; 差異蛋白組學(xué); 基因表達

油菜是我國四大油料作物之一, 是繼水稻、小麥、玉米、大豆之后的第五大農(nóng)作物。近年來, 我國油菜播種面積及產(chǎn)量均居世界前列[1-3], 但國產(chǎn)食用油脂僅占國內(nèi)消費市場的35%~40%, 中國食用植物油供應(yīng)長期處于嚴(yán)重短缺狀態(tài)。

中國北方寒旱區(qū)冬季嚴(yán)寒漫長, 一般抗寒作物因難以在該區(qū)安全越冬, 土地在冬季大量閑置[4]。冬油菜具有喜冷涼的生物學(xué)特性, 如能利用北方冬閑田進行冬油菜種植, 冬油菜出苗后葉片可很快完全覆蓋地表, 能有效降低地表土壤風(fēng)蝕, 同時冬油菜種植能高效利用北方秋末早春光熱水等自然資源, 發(fā)展復(fù)種, 緩解我國使用油脂短缺問題[5]。目前中國北方寒旱區(qū)種植的冬油菜品種均為雜合異質(zhì)群體品種, 栽培群體整齊度差、品種退化快、種性保持困難、產(chǎn)量進一步提高難度大等, 是目前該區(qū)冬油菜種植所面臨的突出問題[6]。

溫(光)敏生態(tài)型雄性不育/可育兩用系, 具有育種程序簡化、親本組配自由、易出強優(yōu)勢組合、雜交種生產(chǎn)成本低等優(yōu)點[7]。雜種優(yōu)勢利用是提高作物產(chǎn)量和增強抗逆性的重要途徑, 雄性不育是雜種優(yōu)勢利用的一種有效遺傳工具[8]。蛋白質(zhì)是基因表達的終產(chǎn)物和基因功能的執(zhí)行者[9], 蛋白質(zhì)在特定組織或發(fā)育的某一階段中表達分析是了解生物學(xué)過程的關(guān)鍵, 對了解雄性不育花藥敗育發(fā)生的原因及其生理生化代謝機制具有重要作用[10]。采用雙向電泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)技術(shù)分離差異蛋白, 對差異蛋白進行質(zhì)譜鑒定, 生物信息學(xué)方法對差異蛋白進行功能富集與分類, 篩選與不育表型關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵蛋白及編碼基因, 是植物生態(tài)型雄性不育/可育兩用系育性轉(zhuǎn)換機制分析的常規(guī)技術(shù)。Zhang等[8]采用2-DE技術(shù)從甘藍型油菜溫敏不育系SP2S花藥中分離出28個差異表達蛋白, 與氨基酸代謝、光合作用、蛋白質(zhì)合成和降解、脂質(zhì)代謝、細胞骨架、RNA修飾、氧化還原酶和防御反應(yīng)等有關(guān)。Xiao等[11]從水稻溫敏不育系ZHU-1S可育/不育花藥中分離出50個差異蛋白點, 質(zhì)譜鑒定出20個蛋白質(zhì)與不育發(fā)生相關(guān)。Song等[12]比較了2個水稻溫敏不育系ZHU-1S和ZHUN S育性轉(zhuǎn)化關(guān)鍵期花藥蛋白組差異, 共分離鑒定出80個差異蛋白質(zhì), 參與了16種細胞代謝途徑。

目前國內(nèi)學(xué)者已在暖溫帶、亞熱帶冬油菜種植群體中, 分離培育出多個甘藍型油菜溫敏不育兩用系[13-16], 在甘藍型油菜雜種優(yōu)勢利用基礎(chǔ)研究和兩系雜交種生產(chǎn)等方面發(fā)揮了重要作用。然而這些溫敏不育系材料適宜冬季溫度溫和的中國南方地區(qū)種植, 屬春性/半冬性不抗寒材料。中國北方寒旱區(qū)冬季嚴(yán)寒漫長、極端低溫低, 在北方冬油菜區(qū)種植上述溫敏不育系材料均不能越冬, 難以應(yīng)用于該區(qū)冬油菜生產(chǎn), 選育強抗寒冬油菜溫敏不育系及其育性轉(zhuǎn)換機制等方面的研究, 對促進北方寒旱區(qū)冬油菜生產(chǎn)具有重要意義。本課題組在強抗寒白菜型冬油菜群體中, 篩選培育出強抗寒溫敏雄性不育系PK3-12S, 通過對溫敏不育系花器官形態(tài)特征、育性轉(zhuǎn)換溫度及遺傳學(xué)和差異蛋白組學(xué)分析, 揭示溫敏不育系PK3-12S育性轉(zhuǎn)換機制, 為白菜型冬油菜雜種優(yōu)勢利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

強抗寒白菜型冬油菜溫敏不育系PK3-12S, 是由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜育種課題組篩選的自然突變體。2015年8月13日盆栽, 每盆留苗4株, 于人工氣候箱培養(yǎng), 設(shè)置光強50~76 μmol m-2s-1, 相對濕度45%, 溫度晝20℃/夜15℃。四葉期至五葉期4℃春化處理28 d, 至開花前7 d時將盆栽植株分成2份, 1份進行高溫27℃/22℃處理, 另1份仍置于晝20℃/夜15℃溫度下, 每份3盆。開花進行育性鑒定后, 取不同大小花蕾混合[幼蕾(幼蕾期)∶大蕾(花萼開裂期)∶花(花期) = 1∶1∶1]后提取總蛋白質(zhì)。試驗進行3次重復(fù)。

在育性遺傳分析中使用的親本材料QX6-2、QX21-2、LX2-3, 及溫敏不育系PK3-12S均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜育種課題組提供, 盆栽苗培養(yǎng)4~5片真葉進行春化處理, 花期去雄雜交獲得F1種子, F1自交獲得F2, F2花期進行育性鑒定與統(tǒng)計。

1.2 方法

1.2.1 白菜型冬油菜PK3-12S花粉形態(tài)觀察及育性鑒定 開花當(dāng)日每株取5個花藥, 用解剖針將花藥切斷將花粉粒擠出, 用I2-KI染色, 根據(jù)染色結(jié)果將花粉粒分為3種類型。(1)典敗: 花粉粒發(fā)育不正常, 呈不規(guī)則形狀, I2-KI染色不著色; (2)圓敗: 花粉粒圓形, I2-KI染色呈淺黃色; (3)正?；ǚ哿? 花粉粒圓形, I2-KI染色均勻且為紅褐色。

1.2.2 白菜型冬油菜PK3-12S遺傳分析 以溫敏不育系PK3-12S為母本, 白菜型冬油菜品系QX6-2、QX21-2、LX2-3為父本, 花期去雄雜交組配組合, F1盆栽低溫培養(yǎng), 花前7 d置于高溫生境, 花期鑒定育性, 并套袋自交和回交。每個組合的F2和BC1, 及F1盆栽種植100株以上, 于花期進行育性鑒定。

1.2.3 白菜型冬油菜PK3-12S花蕾總蛋白提取及2D電泳分離與質(zhì)譜鑒定 采用TCA-丙酮沉淀法提取PK3-12S可育及不育花蕾總蛋白[17], Bradford法[18]測定蛋白質(zhì)濃度; 雙向電泳第一向等點聚焦(IEF)使用17 cm的IPG膠條, 按照GE Healthcare雙向電泳操作手冊進行, 上樣量為900mg; 第二向采用12%丙烯酰胺凝膠的SDS-PAGE, 經(jīng)考馬斯亮藍染色、脫色后通過Powerlook 2100XL掃描采集圖像, 用PDQuest 8.0分析軟件對凝膠圖譜標(biāo)準(zhǔn)化處理, 確定差異表達蛋白點; 試驗重復(fù)3次。回收差異表達蛋白點[19], 進行MALDI-TOF-TOF MS質(zhì)譜鑒定。利用Uniprot Knowledgebase (http://www.uniprot.org/)、NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Gene Ontolo gy Database (GO)的進行注釋。利用在線分析工具KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Automatic Annotation Server (簡稱KAAS) (http:// www.genome.jp/tools/kaas/)提交蛋白質(zhì)序列, 采用BBH (bi-directional best hit)方法比對相似性, 找到最相似的蛋白質(zhì), 確定檢索蛋白質(zhì)的KO (KEGGORTHOLOG)分類, 并獲得參與的代謝通路。

1.2.4 白菜型冬油菜基因克隆 按照天根試劑說明書提取總RNA, 電泳檢測后按PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa公司, 中國大連)說明書進行反轉(zhuǎn)錄, 得到單鏈cDNA, 測定其濃度后, 置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道的白菜型油菜基因的核苷酸序列, 利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物,-F: 5'-ATGTCACCACAAACAGA GACT-3',-R: 5'-CTACTCTTGGCCATCTAATTT- 3'按照十字花科首位序列上設(shè)計, 可擴增出編碼區(qū)全序列。以白菜型冬油菜葉片反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板, 利用引物進行RT-PCR擴增, 擴增程序為94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 78 s, 循環(huán)35次; 72℃ 10 min; 4°C保存。反應(yīng)結(jié)束后1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 利用天根生化科技(北京)有限公司的普通瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒回收目的條帶。將回收產(chǎn)物與pMD-19T載體連接, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞, 過夜培養(yǎng), 藍白斑篩選, 挑白斑進行菌液培養(yǎng)。PCR檢測菌落后, 隨機挑選3個陽性克隆送華大基因公司測序。

1.2.5 白菜型冬油菜溫敏不育系PK3-12S差異表達基因定量分析 分別提取可育和不育期的幼蕾(減數(shù)分裂期)、中蕾期(單核花粉期)、大蕾期花蕾(二核花粉期)總RNA, 反轉(zhuǎn)錄cDNA, 以cDNA為模板, 進行差異表達基因的定量分析。根據(jù)大白菜基因編碼區(qū)序列設(shè)計PK3-12S差異表達基因定量檢測引物見表1, 以濃度一致的cDNA (MR處理及對照)為模板,(Act-F: 5'-TGTGCCAATCTACGAGGGT TT-3'; Act-R: 5'-TTTCCCGCTCTGCTGTTGT-3')為內(nèi)參, 進行熒光定量和半定量PCR。半定量RT-PCR (Analytikjena PCR儀)采用同機分管擴增內(nèi)參基因和目的基因, 電泳檢測, PCR擴增參考SYBR Premix ExII (TliRNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa公司, 中國大連)的熒光定量PCR, 采用兩步法, 擴增程序為94℃ 2 min; 95℃ 5 s, 60℃ 35 s, 40個循環(huán); 95℃ 15 s, 60℃ 1 min, 95℃ 15 s。96孔上樣板目的基因與內(nèi)參基因?qū)?yīng)各3次重復(fù)。采用2?ΔΔCt方法計算, 即ΔCT(目的基因)=CT(目的基因) – CT(內(nèi)參基因); ΔΔCT(目的基因) = 處理組(ΔCT目的基因) – 對照組(ΔCT目的基因), 相對表達量(relative quantification) = 2?ΔΔCt (目的基因)。

表1 差異表達基因定量引物

2 結(jié)果與分析

2.1 溫敏不育系PK3-12S花器形態(tài)特征

低溫生境下, PK3-12S雄蕊表現(xiàn)正常可育, 花瓣平展, 開花流暢, 花藥發(fā)育正常, 色澤淺黃, 花粉數(shù)量多, 花粉粒橢圓形, 染色后呈紅褐色(圖1-A); 在高溫生境中花呈不育形態(tài), 花瓣正常, 與可育時期相似, 但雄蕊退化縮短, 花藥干癟, 無花粉; 柱頭發(fā)育正常, 雌蕊略彎曲(圖1-B)。此外, 白菜型冬油菜生態(tài)型PK3-12S不育時期的花絲長和花藥長分別比可育時期縮短了32.14%、28.27%, 而花瓣大小無明顯變化。

2.2 強抗寒油菜溫敏不育系PK3-12S的遺傳特性

2014年在秦川(蘭州新區(qū)初花期溫度<25℃)試點對PK3-12S自交及3個組合的F1、F2、BC1進行了育性鑒定, 3個組合F1均全可育, F2育性發(fā)生分離, 經(jīng)卡方分析, 可育/不育株數(shù)比符合3∶1分離比例; 3個組合BC1群體可育/不育分離比符合1∶1; 表明PK3-12S的育性受1對隱性基因控制(表2)。

圖1 白菜型冬油菜熱敏感不育系PK3-12S可育(A)和不育(B)花形態(tài)的比較

表2 PK3-12S組合后代育性表現(xiàn)

2.3 白菜型冬油菜PK3-12S花蕾蛋白質(zhì)圖譜及差異表達蛋白質(zhì)分析

提取白菜型冬油菜溫敏不育系PK3-12S低溫下(20℃/15℃)的可育花藥和高溫下(27℃/20℃)的不育花蕾總蛋白質(zhì), 用pH 4~7、17 cm的IPG膠條, 對總蛋白質(zhì)進行分離, 經(jīng)考馬斯亮藍G-250染色后, 得到分辨率較好的2-DE圖譜(圖2)。采用PDQuest8.0.1軟件對2個處理的圖譜進行斑點檢測, 對所有檢測出的蛋白質(zhì)斑點的總濃度進行均一化處理, 在等電點為4.0~7.0, 分子質(zhì)量為9.0~100.0 kD的可育花藥2-DE圖譜上, 可分別鑒定出平均296個蛋白點, 不育花藥2-DE圖譜上可鑒定出278個清晰的蛋白質(zhì)點, 2個處理的蛋白質(zhì)點圖譜匹配率為89.0%。經(jīng)凝膠比對分析發(fā)現(xiàn), 溫敏不育系PK3-12S低溫可育花藥和高溫不育花藥, 表達量2倍以上差異蛋白質(zhì)點共有31個, 其中增量表達蛋白質(zhì)點6個, 減量表達蛋白質(zhì)點11個, 在不育花藥中完全抑制表達蛋白點12個, 不育花藥特異表達蛋白點2個。

圖2 白菜型冬油菜生態(tài)不育系PK3-12可育時期(左)及其不育時期(右)花器全蛋白雙向電泳圖譜

2.4 差異表達蛋白質(zhì)斑點的質(zhì)譜鑒定與分析

將重復(fù)性好的31個差異表達蛋白質(zhì)點進行MALDI-TOF-TOF MS質(zhì)譜分析, 15個點鑒定出蛋白質(zhì)(表3), 16個點未能鑒定出有意義的結(jié)果。在質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上, 用MASCOT搜索NCBInr綠色植物數(shù)據(jù)庫。

表3 PK3-12S可育時期與不育時期花器差異表達蛋白點質(zhì)譜鑒定結(jié)果

+: 上調(diào)表達;-: 下調(diào)表達。+: up regulated;-: down regulated.

2.5 差異蛋白的GO功能富集分析

對白菜型冬油菜溫敏不育花藥和可育花藥差異表達蛋白進行GO和KEGG功能注釋, 15個差異蛋白質(zhì)在三大類群(生物學(xué)過程BP、細胞組分CC和分子功能MF)下進行進一步分類。差異蛋白主要參與冷應(yīng)答響應(yīng)(response to cold)、鋅離子應(yīng)答(response to zinc ion)、細胞分裂素應(yīng)答(response to cytokinin)、花粉管生長調(diào)控(regulation of pollen tube growth)、細胞死亡調(diào)控(regulation of cell death)、蛋白酶活性負調(diào)控(negative regulation of peptidase activity)、芳香族氨基酸生物合成(aromatic amino family biosynthetic process)、分支酸生物合成(chorismate biosynthetic process)、花器發(fā)育(flower development)、葉發(fā)育(leaf development), 每個過程占1.5%; 磷酸甘油酸激酶活性調(diào)節(jié)(phosphoglycerate kinase activity)、超氧化物自由基清除(removal of superoxide radicals)每個過程占3.0%; 創(chuàng)傷應(yīng)答(response to wounding)、鐵離子轉(zhuǎn)運與胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)(iron ion transport and homeostasis)每個過程占4.5%; 生物刺激防御反應(yīng)(defense response to biotic stimulus)占6.0%。

差異蛋白主要為細胞器組分(organelle component)、膜組分(membrane component), 每個過程占9.0%; 大分子復(fù)合物組分(macromolecular complex)、質(zhì)外體組分extracellular region, 每個過程占6.0%; 胞質(zhì)組分(symplast component), 細胞連接成分(cell junction), 各占3.0%。差異蛋白具有Ca2+結(jié)合活性(calcium-binding protein)、Fe2+結(jié)合與鐵氧化酶活性(iron binding and ferroxidase activity)、ATP結(jié)合活性(ATP binding), 分別占4.5%; 半胱氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性(cysteine-type endopeptidase inhibitor activity), 占3.0%; Mg2+-琥珀酰CoA連接酶活性(magnesium ion binding succinate-CoA ligase)、二硫鐵氧還酶活性(thioredoxin-disulfide reductase acti-vity)、蛋白特異結(jié)合結(jié)構(gòu)域(protein domain specific binding)、轉(zhuǎn)移酶活性(transferase activity)、磷酸丙糖異構(gòu)酶活性(triose-phosphate isomerase activity)、超氧化物歧化酶活性(superoxide dismutase activi-ty)、肽內(nèi)切酶活性(endopeptidase inhibitor activity)、軟脂酸結(jié)合活性(cetin binding), 每個過程占1.5% (圖3)。

經(jīng)KEGG注釋15個差異蛋白主要參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(signaling pathway)、二羧基乙醛酸代謝(glyoxylate and dicarboxylate metabolism)、糖酵解代謝(glycolysis gluconeogenesis)、次生合成代謝(biosynthesis of secondary metabolites)、氨基酸生物合成(biontheses of amino acids)、分支酸生物合成(chorismate biosynthesis)、碳代謝途徑(carbon metabolism)等(圖4)。

圖3 差異蛋白GO功能分析

圖4 差異表達蛋白KEGG分類圖

2.6 差異蛋白編碼基因表達定量分析

通過雙向電泳分析獲得的PK3-12S可育花蕾和敗育花蕾的差異蛋白點, 以及GO、KEGG功能分析, 選取了其中與植物雄性不育發(fā)生相關(guān)的差異表達蛋白編碼的基因4個, 即基因, 采用定量RT-PCR進一步驗證其表達量與花藥育性變化的協(xié)同性。結(jié)果顯示, 相對于可育花蕾而言, PK3-12S不育花蕾基因、基因在花蕾發(fā)育各時期均明顯下調(diào)表達,基因下調(diào)幅度57.8%~84.0%,基因下調(diào)幅度在1.43~1.67倍間。比可育花蕾相比, 同一發(fā)育期不育花蕾的基因在發(fā)育期間均下調(diào)表達, 表達量下降幅度為24.2%~62.1% (圖5)。

3 討論

3.1 BrrbcL基因表達與溫敏不育系PK3-12S育性轉(zhuǎn)換

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose-1, 5-isphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco)是綠色植物光合代謝關(guān)鍵限速酶, Rubisco全蛋白由8個大亞基(rbcL)和8個小亞基(rbcS)組成, 酶活性結(jié)構(gòu)域位于大亞基, 小亞基對酶活性起到調(diào)節(jié)作用, 相對而言, 大亞基基因序列同源性很高, 而小亞基基因存在很大序列多態(tài)性[20]。小亞基由核基因編碼, 大亞基則由質(zhì)體基因編碼, 并由葉綠體核糖體負責(zé)翻譯合成, 其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有的L的羧基末端α/β桶狀區(qū)域, 與另一個L的氨基末端區(qū)域構(gòu)成活性中心[21]。許多研究結(jié)果顯示, 植物雄性不育發(fā)生與花蕾Rubisco含量變化相關(guān), 水稻[22]、大豆[23]等作物雄性不育花藥中均檢測到Rubisco或其大亞基含量的下降。同時, 活性氧代謝紊亂也可導(dǎo)致Rubisco氧化修飾、酶活性喪失和降解[24]。

圖5 PK3-12S花器發(fā)育過程中差異蛋白編碼基因的相對表達量

rbcL: 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶; ANN: 膜聯(lián)蛋白; CTIMC: 磷酸丙糖異構(gòu)酶; BetVI: BetVI過敏原家族蛋白。

rbcL: ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase; ANN: annexin; CTIMC: triosephosphate isomerase; BetVI: BetVI allergen family protein.

本研究熒光定量PCR分析結(jié)果表明, 與可育花蕾相比, PK3-12S不育花蕾中Rubisco (spot2)大亞基編碼基因基因顯著下調(diào)表達, rbcL是光合關(guān)鍵酶Rubisco的組件分子, rbcL亞基分子數(shù)量不足阻抑了Rubisco蛋白組裝。差異蛋白組學(xué)分析結(jié)果表明,不育花蕾超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)含量下降, 生物體清除超氧陰離子自由基能力減弱, 有強烈氧化能力的活性氧O2-在胞內(nèi)積累, 受到氧自由基氧化攻擊的Rubisco發(fā)生修飾降解, 使其在胞內(nèi)含量進一步降低。Rubisco作為光合作用的關(guān)鍵酶, 其含量不足限制了不育花蕾光合固碳能力, 光合產(chǎn)物是植物其他代謝途徑的能量基礎(chǔ), 不育花蕾光合固碳能力的下降, 影響了花粉母細胞及小孢子正常發(fā)育, 最終可能導(dǎo)致不育系PK3-12S的雄性敗育。

3.2 丙糖代謝與溫敏不育系PK3-12S雄配子體敗育

糖酵解代謝是糖代謝的基礎(chǔ)途徑, 磷酸甘油酸激酶[25]和磷酸丙糖異構(gòu)酶[26]是該代謝途徑的關(guān)鍵酶,其中磷酸丙糖異構(gòu)催化酶丙糖磷酸異構(gòu)體在二羥丙酮磷酸和D型甘油醛-3-磷酸之間轉(zhuǎn)換[27]; 磷酸甘油酸激酶不可逆催化1,3-二磷酸甘油酸去磷酸化生產(chǎn)3-磷酸甘油酸[28], 2個酶在有效能量生成方面是必不可少的酶類, 其中之一缺失即可引起細胞能量代謝紊亂, 而能量代謝平衡對于小孢子正常發(fā)育至關(guān)重要。本研究中PK3-12S不育花蕾磷酸甘油酸激酶(spot 4)和磷酸丙糖異構(gòu)酶(spot 17)表達量均明顯下調(diào),在小孢子發(fā)育階段, 糖酵解途徑2個關(guān)鍵酶表達異常下調(diào), 阻抑了丙酮酸的生成和三羧酸途徑能量輸出; 同時, 糖酵解和丙糖徹底氧化代謝過程中, 多種性質(zhì)活躍的中間物的生成也受到影響, 造成物質(zhì)合成和能量代謝的紊亂, 引起小孢子正常發(fā)育提前終止, 對雄性不育可能產(chǎn)生一定的影響。

3.3 膜聯(lián)蛋白與溫敏不育系PK3-12S雄配子敗育

膜聯(lián)蛋白是一類水溶性的同源多功能蛋白, 在Ca2+依賴下可與內(nèi)膜和質(zhì)膜結(jié)合或形成跨膜結(jié)構(gòu), 也可以與肌動蛋白結(jié)合, 參與微絲等細胞骨架結(jié)構(gòu)形成[29]。膜聯(lián)蛋白在分子功能上具有過氧化物酶、核酸水解酶活性和離子通道作用, 參與植物響應(yīng)干旱、鹽堿、溫度等環(huán)境脅迫, 在植物極性延伸結(jié)構(gòu)如根、花粉管等的伸長等發(fā)面發(fā)揮重要作用[30], 還參與植物胞內(nèi)過氧化物傷害防御、胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)平衡、細胞骨架形成等。植物花粉母細胞減數(shù)分裂及小孢子發(fā)育過程中, 正常水平的活性氧等自由基產(chǎn)生與清除平衡, 良好胞內(nèi)生理狀態(tài)的維持等是形成正?？捎渥拥幕A(chǔ); 正常的減數(shù)分裂和小孢子發(fā)育過程中, 微管微絲等細胞骨架組分的組裝與去組裝動態(tài), 特別是紡錘絲的牽引作用與染色體運動, 核均等分裂與配子體育性等起到關(guān)鍵作用, 而微管微絲是分裂細胞紡錘狀結(jié)構(gòu)的重要成分[31]。本研究結(jié)果顯示, 在高溫不育條件下, 白菜型冬油菜PK3-12S花藥中膜聯(lián)蛋白(spot 9)表達顯著下調(diào), 表明PK3-12S花藥中微管微絲等細胞骨架成分正確裝配能力降低, 對花粉母細胞減數(shù)分裂和雄配子體發(fā)育產(chǎn)生不利影響, 參與花粉敗育的形成過程。

3.4 活性氧代謝紊亂與PK3-12S雄配子敗育

植物體內(nèi)負責(zé)清除氧自由基的酶系主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)等, 伴隨植物呼吸作用的進行, 其體內(nèi)也不斷地產(chǎn)生對植物細胞有危害作用的活性氧等自由基, 在正常情況下, 植物體內(nèi)活性氧等自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)。在溫度變化等引起的胞內(nèi)活性氧代謝紊亂情況下, 內(nèi)活性氧等自由基積累, 機體受到各種傷害, 導(dǎo)致雄性敗育[32]。對水稻[33]、小麥[34]、油菜[16]等不育系花蕾發(fā)育的研究結(jié)果認(rèn)為, 不育系中保護酶活性下降, 致使活性氧水平升高, 膜脂過氧化作用增強而使細胞受損, 引起小孢子生長發(fā)育出現(xiàn)異常, 從而導(dǎo)致雄性不育的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示, 在高溫條件下, 白菜型溫敏不育系PK3-12S花藥育性轉(zhuǎn)化過程中, 不育花蕾超氧化物歧化酶(spot 18)和具有過氧化物酶活性的膜聯(lián)蛋白(spot 9)表達顯著下調(diào), 表明在敗育條件下PK3-12S花藥胞內(nèi)清除活性氧等自由基能力減弱, 胞內(nèi)活性氧等自由基含量增加, 過量的氧自由基對膜系統(tǒng)具有強烈氧化攻擊作用, 引起胞內(nèi)膜系統(tǒng)氧化損傷, 參與了PK3-12S雄配子體發(fā)育異常產(chǎn)生過程。

3.5 熱激蛋白與PK3-12S雄配子敗育

熱激蛋白屬分子伴侶蛋白, 廣泛存在于高等植物胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體和線粒體中, 協(xié)助新生肽鏈折疊形成正確高級結(jié)構(gòu), 并在蛋白定向轉(zhuǎn)運、恢復(fù)或清除胞內(nèi)變性蛋白、穩(wěn)定分子功能、維持細胞間穩(wěn)態(tài)等方面均發(fā)揮重要作用[35]。當(dāng)植物體熱激蛋白功能被阻抑, 植物水分內(nèi)吸-耗散失衡, 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)新生肽正確折疊效率降低, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工和錯誤結(jié)構(gòu)蛋白清除能力減弱, 錯誤折疊蛋白的胞內(nèi)積累, 引起雄配子體發(fā)育異常[36]。本研究結(jié)果顯示, 在高溫條件下, 白菜型溫敏不育系PK3-12S花藥活性育過程中, 不育花蕾熱激蛋白(spot 20)表達顯著上調(diào)。熱激蛋白是一類誘導(dǎo)表達蛋白, 在花蕾敗育過程中, 胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中錯誤折疊蛋白積累, 誘導(dǎo)表達了熱激蛋白的表達, 這類伴侶分子在細胞中的富集, 提高了新生肽正確加工和已變性肽的清除能力, 清除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)錯誤折疊蛋白, 以緩解 “內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫”。然而在高溫下, PK3-12S小孢子內(nèi)上調(diào)表達的熱激蛋白, 仍不能完全解除錯誤折疊蛋白引起的“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫”, 可能會引起PK3-12S小孢子敗育的發(fā)生。

4 結(jié)論

PK3-12的不育花藥在高溫下形態(tài)較小, 花藥室內(nèi)有少量敗育花粉。與可育花藥相比,、和基因所編碼的蛋白在不育花藥發(fā)育過程中的表達顯著下調(diào), 表明這些蛋白可能參與了溫敏不育系PK3-12S的育性轉(zhuǎn)化。

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Differential proteomics analysis of fertility transformation of the winter rape thermo-sensitive sterile line PK3-12S (L.)

MI Wen-Bo, FANG Yuan, LIU Zi-Gang*, XU Chun-Mei, LIU Gao-Yang, ZOU Ya, XU Ming-Xia, ZHENG Guo-Qiang, CAO Xiao-Dong, and FANG Xin-Ling

Gansu Provincial Key Laboratory of Arid Land Crop Sciences / Key Laboratory of Crop Genetics Improvement and Germplasm Enhancement of Gansu Province / Gansu Research Center of Rapeseed Engineering and Technology / College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu, China

To reveal the fertility switching mechanism of temperature-sensitive sterility line PK3-12S (L.), the differentially expressed proteins were isolated and identified using anthers of PK3-12S in sterile/fertile conditions by 2-DE and LC-MS/MS mass spectrometry. The expression level variations of differentially expressed genes were examined by RT-PCR in PK3-12 flower buds during sterility/fertile development. The result showed that the sterile anther size of PK3-12 was small with a little abortive pollen in the anther room under high temperature. The trait of fertility transformation was controlled by a pair of recessive alleles. There were 31 differentially expressed proteins with more than two times of the expression level, including six protein spots with increasing expression, 11 protein spots with reduced expression, 12 protein spots with complete inhibition, and two protein spots with induced expressed. Fifteen differentially expressed proteins involved in the cellular processes such as signal transduction pathways, glyoxylate and dicarboxylate metabolism, glycolysis gluconeogenesis, biosynthesis of secondary metabolites, biontheses of amino acids, chorismate biosynthesis, and carbon metabolism pathways were identified by mass spectrometry. Thegene, encoding a Rubisco subunit-binding accessory protein, had an open reading frame (ORF) in length of 1095 bp encoded 364 amino acids. Compared with fertile anthers, the expression level ofgene, annexin gene () and BetVI allergen family gene () was significantly down-regulated during sterile anthers development, which indicated that these genes maybe participate in the fertility transformation of the thermo-sensitive sterile line PK3-12S.

winter turnip rape (L.); thermo-sensitive sterile line; proteomics; gene expression

10.3724/SP.J.1006.2020.04015

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31660404), 國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目(2018YFD0100502-2), 甘肅省高校科研成果轉(zhuǎn)化培育項目(2018D-13), 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-13)和甘肅省科技重大專項項目(17ZD2NA016-4)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31660404), the National Key Basic Research Development Program (2018YFD0100502-2), the Gansu University Scientific Research Achievement Transformation and Cultivation Project (2018D-13), the National Modern Agricultural Industry Technology System Construction Project (CARS-13), and the Gansu Science and Technology Major Special Project (17ZD2NA016-4).

劉自剛, E-mail: lzgworking@163.com

E-mail: 1291402843@qq.com

2020-01-17;

2020-04-15;

2020-05-14.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200513.1814.004.html