蜂王漿特有成分10-HDA 的研究進展

繆卓寧，胡福良

（浙江大學動物科學學院，浙江 杭州 310058）

1 引言

10- 羥基-△2- 癸烯酸（10-hydroxy-△2-dece-noic acid，10-HDA） 是蜂王漿特有的脂肪酸，俗稱王漿酸，是蜂王漿的標志物。人們對10-HDA 的研究, 可以追溯到20 世紀40年代甚至更早。 Townsend 和Luas(1940)全面分析了蜂王漿的理化性質[1]。有趣的是，在用乙醚提取的過程中，他們發(fā)現(xiàn)了一種脂肪酸。經過一系列有機化學分析測試后， 排除了內酯或內酯酐的可能, 并得到脂肪酸的分子式為C10H18O3,奇怪的是，他們發(fā)現(xiàn)碳鏈上不存在不飽和鍵。 關于這種脂肪酸的具體結構的困惑持續(xù)了將近20年, 直到Butenandt (1957)首次從蜂王漿中分離出這一脂肪酸，并且，他通過紅外光譜方法首次確定了其結構為10-羥基-2- 癸烯酸[2]， 隨后Barker(1959)等經核磁共振確認其為反式異構體[3]。隨后在Brown 和Frere(1959)等人的進一步努力下, 通過輻照生成空間異構體才最終確定雙鍵兩側基團呈反式排列(圖1)。

圖1 10-HDA 結構示意圖

它之所以被稱為王漿酸，是因為其獨一無二的結構，至今為止只在蜂王漿中發(fā)現(xiàn)，使之當之無愧成為了蜂王漿的代表物質。

10-HDA 的發(fā)現(xiàn)和確認引發(fā)了國內外學術界對蜂王漿中脂肪酸的探究熱潮，從結構、性質、生理活性及其含量的測定方法等方面對10-HDA 進行了深入的研究。

2 10-HDA 生理活性的研究

10-HDA 具有十分廣泛的生物學活性，主要表現(xiàn)在以下幾個方面。

2.1 抗菌活性

10-HDA 被認為是一種特別強的抗菌劑，Alreshoodi(2015)等人的研究表明10-HDA 對金黃色葡萄球菌、 大腸桿菌和大腸桿菌枯草芽孢桿菌抑菌效果極強[4]。除此之外，Yousefi(2012)等人發(fā)現(xiàn)該脂肪酸通過干擾葡糖基轉移酶gtfB 和gtfC 的表達來干擾口腔病原體變形鏈球菌對細胞表面的粘附[5]。 與此同時，Melliou(2005)等人的結果也表明10-HDA 對熱帶念珠菌和白色念珠菌等真菌有良好的抗菌活性[6]。

2.2 抗炎活性

在Fang(1994)等人的一項關于蜂王漿可能導致消化系統(tǒng)疾病的研究中他們發(fā)現(xiàn)10-HDA可以保護大鼠免受實驗性胃潰瘍的傷害[7]。此外，Sugiyama(2012)等人在鼠巨噬細胞RAW264細胞系的研究中表明， 10-HDA 是通過抑制LPS 誘導的NF-kB 信號通路的活化來發(fā)揮其抗炎癥活性[8]。 隨后，陳伊凡(2018)等人的結果從體內和體外的角度驗證其抗炎活性，10-HDA 對炎癥介質和NO 的主要釋放的抑制作用是有效的，并存在劑量依賴性。并且IL-1β，IL-6，MCP-1 和COX-2 等幾種關鍵炎癥基因也被10-HDA 抑制[9]。另有 Wang(2015)等人的研究顯示類風濕性關節(jié)炎患者的成纖維樣滑膜細胞具有10-HDA 抑制作用，這也證明了其對慢性炎癥退行性疾病的治療潛力[10]。

2.3 免疫調節(jié)活性

目前已經報道了10-HDA 的各種免疫調節(jié)活性，包括10-HDA 通過抑制活化T 細胞的IL-2Rα 的表達和IL-2 的產生達到抑制異種T 細胞的增殖的效果[11]。除此之外，石晶(1990)等人發(fā)現(xiàn)10-HDA(50，100 mg／L)能提高巨噬細胞的吞噬活性，一定量的提高免疫系統(tǒng)活性[12]。與此同時，Gasic (2007)和Sugiyama (2013) 等人的研究結果表明10-HDA 能抑制脾樹突狀細胞產生白介素12以及抑制巨噬細胞中LPS 和IFN-β 誘導的NO 產生[13-14]。在另一項研究中，Mihajlovic(2013)等人發(fā)現(xiàn)10-HDA 在人單核細胞衍生的樹突狀細胞上具有雙相行為，導致Th1 反應刺激和Th2 在50μM 下調，并在500μM 抑制Th1 和Th2[15]。

2.4 抗衰老活性

Honda(2015)等人發(fā)現(xiàn)10-HDA 可能通過飲食限制和TOR 激酶信號傳導來延長線蟲的壽命并賦予其耐熱和氧化應激耐受性[16]。Koya-Miyata (2004)和Park(2011)等人的研究表明10-HDA 促進人皮膚成纖維細胞中增加膠原蛋白的合成和膠原蛋白促進因子（轉化生長因子β1） 的產生，這種作用介導了蜂王漿皮膚對UVB 誘導的光老化的保護作用[17-18]。除了促進膠原蛋白合成外，Yang(2010)和Wang(2012)等人還發(fā)現(xiàn)10-HDA 可能通過下調涉及JNK /p38 MAP 激酶和AP-1 轉錄因子的途徑來抑制類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞釋放MMP-1 和MMP-3[19]和MMP 調節(jié)劑結締組織生長因子[20]。并且，Zheng (2013)等人發(fā)現(xiàn)10-HDA 還抑制了成纖維細胞中UVA 誘導的JNK/p38 活化以及MMP-1 和MMP-3 的上調[21]。

2.5 抗腫瘤活性

Izuta(2009)等人實驗表明10-HDA 促進具有抗癌活性和免疫調節(jié)作用的白細胞介素2 和淋巴細胞亞群的生長[22]。除此之外，Pengpanich 和Srisuparbh (2019)發(fā)現(xiàn)10-HDA 不僅降低了三惡性乳腺癌細胞（TNBC） 的細胞存活率，而且10-HDA 處理細胞后，顯著抑制TNBC 的侵襲、粘附和釋放，對侵襲性乳腺癌細胞具有抗轉移活性[23]。

2.6 抗輻射活性

Zheng(2012)等人的研究表明了10-HDA 對紫外線（UV） A 誘導的人皮膚成纖維細胞（HDFs） 的保護作用。10-HDA 通過抑制紫外線A 誘導產生細胞毒性和活性氧(ROS)，和刺激膠原蛋白生成，來達到保護HDF 的目的。此外，10-HDA 在轉錄和蛋白質水平上均抑制UVA 誘 導 的 MMP-1 和 MMP-3 表 達。10-HDA 處理還減少了UVA 誘導的JNK 和p38 MAPK 途徑的激活[24]。另有Park(2011)等人的研究表明，10-HDA 可與蜂王漿中其他脂肪酸組分發(fā)生協(xié)同作用，通過刺激UVB 誘導的NHDF 中TGF-β1 的產生來上調I 型膠原蛋白的水平[25]。

2.7 降血糖活性

Xu(2002)等人已發(fā)現(xiàn)該脂肪酸可改善大鼠模型的高脂血癥狀況[26]。此外，Takikawa(2013)等人的針對L6 肌管的體外研究以及針對小鼠的體內研究均表明10-HDA 通過AMP 激活的蛋白激酶活化和GLUT4 轉運至質膜來增強胰島素非依賴性肌肉葡萄糖攝取[27]。

2.8 神經調節(jié)活性

Terada(2011)等人證明10-HDA 和10- 羥基-2-癸烯酸是人類TRPA1 和TRPV1 受體的有效激動劑[28]。此外，Hattori (2007)等人的研究表明10-HDA 刺激了大鼠胚胎神經干細胞的神經元分化，可能起著ω-3 二十二碳六烯酸的作用。ω-3 二十二碳六烯酸是一種必需的飲食成分，已知會促進中樞神經系統(tǒng)的神經發(fā)生。二十二碳六烯酸被認為對大腦發(fā)育和功能必不可少， 并且已在大鼠帕金森氏模型中顯示出積極作用，這表明10-HDA 的潛力相似，此外，由于10-HDA 是較小的分子，它還可以更容易地穿過血腦屏障[29]。Hirakawa(2010)等人的關于合成中鏈脂肪酸的研究也表明了蜂王漿脂肪酸的神經生成潛能，其中2- 癸烯酸乙酯（10-HDA 的衍生物） 促進了大鼠模型的功能恢復[30]。另有Pyrzanowska(2012)等人的研究顯示，10-HDA 增加神經元的生成[31]。

3 10-HDA 含量測定方法

鑒于10-HDA 作為蜂王漿的化學指標已被普遍接受，測定10-HDA 含量的方法已有很多種。隨著色譜法以及其他相關技術的發(fā)展，分光光度法和色譜法等原始測定方法得到不斷的改進與優(yōu)化。與此同時，新測定方法如雨后春筍般層出不窮，如ELISA法等。

3.1 分光光度法

目前對分光光度計的研究集中在最佳波長的選擇和樣品前處理的改進上。

趙靜(1998)研究表明，使用三波長紫外光譜法來測定 10-HDA 的含量，可減輕干擾因子的影響，使傳統(tǒng)紫外光譜法帶來的測量結果偏高的問題得到改進[32]。近年來出現(xiàn)了不需要將樣品事先分離即可消除共有組分的干擾的方法，如示差分光光度法，簡便準確。

3.2 色譜法

李青(2000)等人先用一定量的甲醇萃取10-HDA，快速震蕩混勻1 min 后，取上清液， 然后通過大口徑毛細管交聯(lián)柱分離， 并使用氫火焰檢測器檢測，保持柱溫在180℃，進樣口240℃，氣相色譜法直接測定，該方法消除了其他脂肪酸的干擾[33]。劉滿倉(1996)等人開發(fā)了一種只需稀釋的高效液相色譜方法[34]， 10-HDA 的測定變得更為方便省時。李蔚(2005)等人用Waters Oasis HLB 固相萃取小柱處理樣品，使樣品中的10-HDA 富集，其他雜質用水洗去后，然后用少量甲醇洗脫10-HDA，以實現(xiàn)相當程度的富集。該方法簡便，雜質去除完全[35]。

3.3 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

潘榮生(2001)等人在測定10-HDA 時首次使用了這一方法，該方法的原理是先通過酯化保護10-HDA 中的原始羧基，再加入琥珀酸酐，與結構另一端的羥基反應，引入一個帶有羥基的“橋”。將這個“橋”通過混合酸酐法與載體蛋白偶聯(lián)，制備得到10-HDA 免疫原。酶聯(lián)免疫吸附法方便快捷且準確， 通過和液相色譜法平行對比，結果符合率為95%[36]。

4 10-HDA 提取工藝

4.1 乙醚萃取法

定量稱量蜂王漿，將其溶解在乙醇中，離心后棄沉淀，加入1 ∶1 體積比的乙醚進行萃取，震蕩，靜置10 min，分層后，使用分液漏斗分液，乙醚層在40℃常壓下用旋轉蒸發(fā)器蒸出，然后將燒瓶中的殘留物溶于少量乙醇（約2 mL） 中，于低溫下靜置結晶。

4.2 乙醇萃取法

稱取一定量的蜂王漿放入三角燒瓶中，以1 ∶ 3 的比例加入95%的乙醇，充分振蕩， 靜置2 h，以5000 r／min 的轉速離心20 min，棄去沉淀，取上清液，向上清液中加入3 倍體積的去離子水進行反萃取， 震蕩后放于-20℃冰箱中結晶5 h。結晶后，趁冷微濾，并將濾餅置于室內風干，然后將其移至真空干燥器中干燥60 min 左右后得最終產物10-HDA。

5 結語

21 世紀以來，隨著社會經濟與生活水平的提高,人們對于功能性天然保健品的需求正在迅速增長?；谕鯘{酸10-HDA 具有多種生理學活性, 是純天然的生物保健品，10-HDA 存在著巨大的發(fā)展前景。 它對腫瘤起到有效的抑制作用，有作為放療和化療理想的輔助藥物的潛力, 有改善機體的免疫系統(tǒng)活性的功能，因此作為預防癌癥的新藥，市場更加廣闊。然而，目前10-HDA 抗癌具體工作機制尚未明確，對于10-HDA 與許多種類的腫瘤的作用研究也尚屬空白，還有許多工作需要深入探究。