甘藍(lán)型油菜響應(yīng)低氮脅迫的表達(dá)譜分析

肖 燕 姚珺玥 劉 冬 宋海星 張振華

甘藍(lán)型油菜響應(yīng)低氮脅迫的表達(dá)譜分析

肖 燕**姚珺玥**劉 冬 宋海星 張振華*

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院 / 南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 湖南長沙 410128

隨著人們對(duì)作物產(chǎn)量的需求不斷提高, 氮肥被過量施用, 而作物的氮素利用率(NUE)卻在不斷降低。本研究從低氮脅迫下油菜的生理變化入手, 結(jié)合高通量的數(shù)字基因表達(dá)譜測序技術(shù), 分析了油菜在低氮0、3、72 h下的轉(zhuǎn)錄組差異響應(yīng), 鑒定了氮的吸收﹑轉(zhuǎn)運(yùn)﹑分配和轉(zhuǎn)錄因子等方面的差異表達(dá)基因。結(jié)果表明, 甘藍(lán)型油菜在低氮處理后, 氮優(yōu)先分配到地上部, 硝酸還原酶(NR)活性顯著降低, 而谷氨酞胺合成酶(GS)活性升高, 油菜植株總氮濃度降低, NUE升高?；蚧虮疚徽?GO)功能與京都基因和基因組百科全書(KEGG)代謝通路分析表明, 地上部差異表達(dá)基因主要是參與代謝過程、蛋白結(jié)合、離子結(jié)合、陰離子結(jié)合等, 根中差異表達(dá)基因主要是參與分子功能、初級(jí)代謝過程、離子結(jié)合、陰離子結(jié)合等?；虮磉_(dá)譜分析表明, 低氮脅迫72 h后, 根中家族基因表達(dá)大部分升高; 根中和的基因表達(dá)量降低;、和亞家族中的大部分基因的表達(dá)量降低;家族中的大部分基因表達(dá)上調(diào); 在和亞家族中, 根中(BnaA06g04560D)、(BnaA06g04570D)、(BnaA02g11760D)、(BnaC02g16150D)的表達(dá)上調(diào)。同時(shí), 地上部和根發(fā)生外顯子跳躍(SE), 外顯子選擇性跳躍(MXE)類型的可變剪接積極加強(qiáng)對(duì)低氮的適應(yīng)?？偠灾? 在低氮處理下, 甘藍(lán)型油菜可以通過調(diào)控家族基因提高NUE以及調(diào)控、家族和可變剪接積極適應(yīng)低氮脅迫。

甘藍(lán)型油菜; 低氮脅迫; NO3-; 可變剪接

氮(N)是植物生物量和作物產(chǎn)量必需的營養(yǎng)元素[1]。植物必須從土壤中獲取豐富的氮資源, 以滿足植物正常生理發(fā)育。在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中, 氮素利用效率(NUE)比較低, 每年需要施用大量氮肥以維持作物生產(chǎn)力。而氮肥的過量施用造成一定的資源浪費(fèi), 并對(duì)環(huán)境構(gòu)成污染, 因此在減少施氮量的同時(shí)提高NUE是可持續(xù)農(nóng)業(yè)和生態(tài)系統(tǒng)良性發(fā)展的關(guān)鍵。

低氮脅迫下, 植物可以通過誘導(dǎo)根生長來增加對(duì)氮的吸收[2], 氮高效的水稻品種通過誘導(dǎo)NO3-轉(zhuǎn)運(yùn)子使地上部累積更多的氮, 來促進(jìn)光合作用, 提高碳、氮同化效率[3]。與谷類作物不同, 甘藍(lán)型油菜(L.)對(duì)最優(yōu)種子產(chǎn)量具有相對(duì)較高的N營養(yǎng)需求[4-5], 合適的氮水平可以促進(jìn)光合效率, 并增加干物質(zhì)累積量[7], 而適當(dāng)?shù)牡偷幚砜梢栽黾佑筒说腘UE[6]。事實(shí)上, 盡管油菜具有強(qiáng)大的NO3-吸收能力, 但油菜仍然是目前已知作物中NUE最低的[7]。

甘藍(lán)型油菜(, AnAnCnCn, 約1345 Mb, 2= 4= 38)屬于十字花科蕓薹屬油料作物[8], 全基因組包含約十萬多個(gè)蛋白編碼基因, 由白菜(, ArAr, 約485 Mb, 2= 2= 20)和甘藍(lán)(, CoCo, 約630 Mb, 2= 2= 18)這2個(gè)二倍體基本種通過天然遠(yuǎn)緣雜交形成的異源四倍體作物[9]。本研究中采用的油菜品種為湘油15號(hào), 是由湘油10號(hào)為父本, 湘油11號(hào)為母本雜交, 經(jīng)多年選育的雙低油菜, 是一種高NUE品種[10]。

近年來, 伴隨測序技術(shù)的迅猛發(fā)展和測序成本的大幅下降, 高通量測序已經(jīng)成為植物基因組和轉(zhuǎn)錄組(或數(shù)字基因表達(dá)譜)等眾多組學(xué)研究的首選分析測試手段, 極大地推進(jìn)了基因組學(xué)和分子生物學(xué)等多種學(xué)科領(lǐng)域的研究進(jìn)展。已有學(xué)者對(duì)多份谷子核心種質(zhì)在低氮處理下的表型進(jìn)行了分析, 并選擇耐低氮的品種進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析, 進(jìn)而篩選到可能參與低氮脅迫響應(yīng)的基因并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)分析[11]。并且不少研究表明, 轉(zhuǎn)錄因子在植物生命活動(dòng)中起著非常重要的作用, 轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)來適應(yīng)非生物脅迫[12-14]。

雖然越來越多的研究從組學(xué)入手, 深入解析植物在低氮脅迫下的響應(yīng)[15-16], 但是關(guān)于NUE高效油菜在低氮脅迫下的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)的研究比較少。本研究鑒定了在低氮處理下甘藍(lán)型油菜產(chǎn)生的異常形態(tài)與生理生化紊亂。隨后, 利用高通量的數(shù)字基因表達(dá)譜測序技術(shù)分析了油菜在低氮0、3、72 h下的轉(zhuǎn)錄組差異響應(yīng), 鑒定了氮的吸收﹑轉(zhuǎn)運(yùn)﹑分配和轉(zhuǎn)錄因子等方面的差異表達(dá)基因。該研究旨在提高對(duì)油菜響應(yīng)低氮脅迫的分子機(jī)制認(rèn)識(shí), 為鑒定和培育適應(yīng)低氮的NUE高效的作物種質(zhì)資源提供部分理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用油菜品種湘油15號(hào) (XY15), 由國家油料改良中心湖南分中心提供。

1.2 營養(yǎng)液培養(yǎng)試驗(yàn)

試驗(yàn)在本課題組油菜光照培養(yǎng)室中進(jìn)行。溫度設(shè)置為22℃, 光照周期為14 h光照/10 h黑暗, 光照強(qiáng)度為300~320 μmol m-2s-1, 濕度為60%~75%。選取大小一致、籽粒飽滿的油菜種子, 使用1%的NaClO滅菌處理10 min; 將種子表面沖洗干凈后, 4℃避光條件下用超純水浸泡種子24 h。將浸泡過后的種子均勻播于紗布上用超純水育苗。育苗1周后, 將長勢(shì)一致的幼苗移栽至盛有10 L營養(yǎng)液的黑色塑料盆中。

營養(yǎng)液試驗(yàn)中的大量元素營養(yǎng)液采用Hoagland配方, 微量元素營養(yǎng)液采用Arnon配方[17]。每隔5 d更換1次營養(yǎng)液, 初始營養(yǎng)液為1/4濃度營養(yǎng)液, 隨后為1/2濃度營養(yǎng)液, 最后為全量營養(yǎng)液。試驗(yàn)設(shè)置正常氮水平(NO3-9.0 mmol L-1)和低氮水平(NO3-0.3 mmol L-1) 2個(gè)氮水平。

1.3 取樣及測定方法

采用Hoagland溶液進(jìn)行水培油菜幼苗, 在整個(gè)試驗(yàn)過程中不斷曝氣, 每隔5 d更新一次[18]。以正常氮水平(NO3-9.0 mmol L-1)水培油菜品種湘油15號(hào)(XY15)的幼苗10 d, 然后轉(zhuǎn)移到低氮水平(NO3-0.3 mmol L-1)。在0、3和72 h后分別對(duì)XY15幼苗的地上部和根進(jìn)行取樣。將新鮮根和葉研磨成細(xì)粉(約100 mg), 然后提取并用Ehlting等[19]描述的分光光度法測定NR活性。用Wang等[20]報(bào)道的方法測定GS活性。根據(jù)Patterson等[21]的研究, 在410 nm處用分光光度法測定了油菜根和葉中NO3-的濃度。用Wang等[22]報(bào)道的方法測定了油菜的總氮含量。根據(jù)Li等[23]的計(jì)算方法, NUE = 總生物量/總氮積累。

1.4 數(shù)字基因表達(dá)譜分析

采用高通量的數(shù)字基因表達(dá)譜測序進(jìn)行全基因組的基因表達(dá)分析, 測序平臺(tái)為Illumina HeSeq 4000平臺(tái)上的高通量轉(zhuǎn)錄組測序(NooGeNe, 中國北京), 測序方式為單端測(single-end, SE), 單條reads讀長為50 bp, 單個(gè)樣品的測序reads數(shù)目為20 M條, 單個(gè)樣品獲得的數(shù)據(jù)量約為1.2 Gb。

由于原始測序數(shù)據(jù)可能包含低質(zhì)量序列和接頭序列等, 為保證信息分析結(jié)果的可靠性, 需要經(jīng)過一系列數(shù)據(jù)處理來過濾這些包含雜質(zhì)的raw reads, 具體步驟如下: (1)去除含adapter的reads; (2)去除含N (表示無法確定堿基信息)比例大于10%的reads; (3)去除低質(zhì)量reads (質(zhì)量值≤5的堿基數(shù)占整條read的50%以上)。過濾后的數(shù)據(jù)稱為clean reads。

利用Euclidean距離算法計(jì)算各個(gè)樣品基因的表達(dá)量距離, 利用離差平方和(Ward)算法計(jì)算樣品間的距離, 根據(jù)距離大小建立聚類圖。聚類圖能直觀的反映出樣品之間的距離關(guān)系和差異關(guān)系, 聚類圖的縱坐標(biāo)表示聚類樹中的高度, 高度接近的生物學(xué)樣品容易聚在一起。在基因表達(dá)的聚類分析中, 本研究利用Cluster軟件[24], 以歐氏距離為矩陣計(jì)算公式, 對(duì)樣品表達(dá)基因和樣品方案同時(shí)進(jìn)行分層聚類分析, 聚類結(jié)果用JavaTreeview[25]顯示。在基因表達(dá)的聚類圖中, 每列代表一個(gè)生物學(xué)樣本, 每行代表一個(gè)基因, 不同表達(dá)量用不同的顏色表示, 紅色表示高表達(dá), 藍(lán)色表示低表達(dá)?；虻腉O功能注釋使用WEGO軟件[26]進(jìn)行分析, 從宏觀上認(rèn)識(shí)基因的功能分布; 本研究使用KEGG[27]公共數(shù)據(jù)庫對(duì)基因Pathway富集分析。使用NOISeq方法鑒定不同時(shí)間低氮處理之間的差異表達(dá)基因[28], 其篩選標(biāo)準(zhǔn)為: |log2Fold-change|≥2且FDR < 0.05。

基因表達(dá)定量的結(jié)果以FPKM為單位, 具體計(jì)算公式如下: FPKM=106/(NL103)。設(shè)FPKM(A)為基因A的表達(dá)量, 則為比對(duì)到基因A的Fragments數(shù),為比對(duì)到參考基因的總Fragments數(shù),為基因A編碼區(qū)的堿基數(shù)。FPKM法能夠消除基因長度和測序量差異對(duì)基因表達(dá)的影響, 計(jì)算得到的基因表達(dá)量可直接進(jìn)行不同樣品間的基因差異表達(dá)分析?；虮磉_(dá)譜的熱圖譜由Multiexperiment Viewer (MEV, http://www.tm4.org/ mev.html)描繪[29]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和相關(guān)分析, 不同處理間采用最小顯著差數(shù)法(LSD法)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(< 0.05), 采用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)型油菜響應(yīng)低氮脅迫的生理差異

當(dāng)NO3-供應(yīng)不足時(shí), 植物對(duì)有限的氮生長條件產(chǎn)生一系列適應(yīng)性反應(yīng)[30]。以油菜為試材, 生長10 d后, 在低氮(0.30 mmol L-1NO3-)條件下進(jìn)行水培試驗(yàn), 測定了油菜對(duì)氮限制的生理反應(yīng)。詳細(xì)研究了植物對(duì)短期(3 h)和長期(72 h)低氮(0.30 mmol L-1)脅迫的反應(yīng)。由圖1-A可知, 在低氮處理下, 氮資源優(yōu)先分配到地上部, 以滿足光合作用的需要。氮代謝相關(guān)酶分析結(jié)果表明, NR活性在根和地上部中均顯著降低(圖1-E), 而GS活性在低氮處理下升高(圖1-F)。低氮處理3 h生物量較低氮0 h無顯著差異, 低氮處理72 h后, 其生物量較低氮0 h和3 h顯著增加(圖1-D), 在低NO3-條件下處理3 h后, 隨著氮素限制時(shí)間的延長, 油菜植株總氮濃度顯著降低(圖1-B), 而氮素耗竭則提高了油菜植株的NUE (圖1-C)。與充足的NO3-供應(yīng)相比, 低氮誘導(dǎo)了油菜植株顯著的生理變化。

2.2 甘藍(lán)型油菜全基因組數(shù)字基因表達(dá)譜

為了鑒定甘藍(lán)型油菜在全基因組水平上對(duì)低氮脅迫的分子響應(yīng), 我們利用Illumina HeSeq 4000 (NooGeNe, 中國北京)進(jìn)行高通量的數(shù)字基因表達(dá)譜測序。其中轉(zhuǎn)錄組原始序列測序數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳至NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的SRA (https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=)中, 其中BioProject ID為PRJNA340053。在去除接頭序列和低質(zhì)量的reads后, 每個(gè)測序樣品獲得4.2×107至5.7×107條reads, 堿基質(zhì)量值Q20均在96%以上, Q30均在91%以上, GC含量也均在45%以上, 錯(cuò)誤率均在0.02%以下(表1)。

圖1 油菜對(duì)氮(N)脅迫的生理響應(yīng)

A: 根部NO3-濃度與地上部NO3-濃度的比值; B: 植株總N濃度; C: 氮利用效率(NUE), NUE=總干重/總N含量; D: 總生物量(單株植物干重 DW); E: 地上部和根部硝酸還原酶(NR)活性; F: 地上部和根部谷氨酰胺合成酶(GS)活性。數(shù)值表示平均值(= 5), 誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)值。

A: the ratio of root NO3-concentration to shoot NO3-concentration; B: the total N concentration; C: the nitrogen use efficiency (NUE) value, NUE = total dry weight / total N content; D: the total biomass (per plant dry weight DW); E: the nitrate reductase (NR) activity in shoots and roots; F: glutamine synthase (GS) activity in shoots and roots. Data present means (= 5), the error bars denote the standard error (SE) value.

表1 數(shù)字基因表達(dá)譜測序數(shù)據(jù)概況

S0和R0分別表示未做低氮處理的地上部和根; S3和R3分別表示低氮處理3 h后的地上部和根; S72和R72分別表示低氮處理72 h后的地上部和根。

S0 and R0 represent the shoots and roots without low nitrogen treatment, respectively; S3 and R3 indicate the shoots and roots after 3 h under low nitrogen treatment, respectively; S72 and R72 denote the shoots and roots after 72 h under low nitrogen treatment, respectively.

為了評(píng)估低氮處理同一時(shí)間下3個(gè)生物學(xué)材料之間的相關(guān)性, 通過每2個(gè)生物學(xué)重復(fù)之間標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)譜, 計(jì)算得出它們的Pearson相關(guān)性系數(shù)。結(jié)果表明, 在同一處理下的地上部或者根系中, 每2個(gè)生物學(xué)重復(fù)之間的相關(guān)性系數(shù)基本都在0.95以上(圖2)。

基因表達(dá)差異的分析以低氮處理0 h作為對(duì)照, 低氮處理3 h和72 h后, 地上部分別檢測到12,719個(gè)和10,066個(gè)差異表達(dá)基因; 根中分別檢測到9204個(gè)和13,400個(gè)差異表達(dá)基因。低氮3 h和72 h下, 分別在地上部特異性地檢測到5677個(gè)和3550個(gè)差異表達(dá)基因; 根中特異性地檢測到3359個(gè)和5832個(gè)差異表達(dá)基因(圖3)。

為了進(jìn)一步鑒定差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能, 本研究進(jìn)行了基因GO功能與KEGG代謝通路分析。差異表達(dá)基因富集分析結(jié)果表明, 低氮處理72 h的條件下, 地上部差異表達(dá)基因主要是參與代謝過程、蛋白結(jié)合、離子結(jié)合、陰離子結(jié)合等(圖4-A), 根中差異表達(dá)基因主要是參與分子功能、初級(jí)代謝過程、離子結(jié)合、陰離子結(jié)合等(圖4-B)。KEGG代謝通路分析結(jié)果表明, 低氮處理72 h, 地上部的差異表達(dá)基因涉及最多的通路是代謝通路(圖4-C), 該結(jié)果與差異表達(dá)基因的GO富集分析具有較高的一致性。根中的差異表達(dá)基因涉及最多的通路是與剪接體、核蛋白體以及碳代謝相關(guān)(圖4-D)。

圖2 油菜幼苗地上部和根系的Pearson相關(guān)性系數(shù)熱圖

S0和R0分別表示未做低氮處理的地上部和根; S3和R3分別表示低氮處理3 h后的地上部和根; S72和R72分別表示低氮處理72 h后的地上部和根。

S0 and R0 represent the shoots and roots without low nitrogen treatment, respectively; S3 and R3 indicate the shoots and roots after 3 h under low nitrogen treatment, respectively; S72 and R72 denote the shoots and roots after 72 h under low nitrogen treatment, respectively.

圖3 低氮0, 3, 72 h下油菜地上部和根的差異表達(dá)基因

A: 差異表達(dá)基因的維恩圖分析; B: 差異表達(dá)基因數(shù)目。S0和R0分別表示未做低氮處理的地上部和根; S3和R3分別表示低氮處理3 h后的地上部和根; S72和R72分別表示低氮處理72 h后的地上部和根。

A: the venn-graph analysis of the DEGs; B: the number of the DEGs. S0 and R0 represent the shoots and roots without low nitrogen treatment, respectively; S3 and R3 indicate the shoots and roots after 3 h under low nitrogen treatment, respectively; S72 and R72 denote the shoots and roots after 72 h under low nitrogen treatment, respectively.

2.3 油菜GLNs家族基因?qū)Φ偷{迫的表達(dá)反應(yīng)

在擬南芥全基因組中, GLNs家族共存在6個(gè)成員(~,), 目前已證明其功能是調(diào)控谷氨酰胺合成酶[31]。本研究用擬南芥的GLNs基因序列在甘藍(lán)型油菜Database (BRAD)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTn比對(duì), 用以檢索油菜基因組中的家族基因。在油菜全基因組范圍內(nèi), 共同源比對(duì)到20個(gè)家族基因, 包括2個(gè)﹑2個(gè)﹑6個(gè)﹑4個(gè)﹑2個(gè)﹑4個(gè)。

本研究共檢測到19個(gè)家族基因響應(yīng)低氮處理?？傮w上,家族基因主要在根部和地上部均有表達(dá)(圖5-A)。低氮處理后, 在s亞家族中,(BnaA04g08160D)在根中表達(dá)量顯著上升,(BnaC04g30250D)地上部和根中表達(dá)均有顯著上升(圖5-B);在根中的表達(dá)量在低氮72 h后有顯著上升(圖5-C); 在亞家族中,(BnaA03g 34780D)和(BnaC03g40250D)在根中的表達(dá)量低氮72 h后顯著上升, 且地上部的(BnaC03g40250D)在低氮72 h后表達(dá)量也顯著上升(圖5-D);亞家族在受到低氮脅迫后, 部分基因的根中表達(dá)量上升(圖5-E);(BnaC06g02010D)在地上部和根中的表達(dá)量受到低氮脅迫的顯著誘導(dǎo)(圖5-F);亞家族基因主要在地上部表達(dá), 根中(BnaC04g29670D)在低氮脅迫后表達(dá)上調(diào)(圖5-G)。家族基因在低氮處理后總體呈上升趨勢(shì), 與GS活性基本一致(圖1-E)。

圖4 油菜地上部和根系中差異表達(dá)基因的GO、KEGG富集分析

A: 在低氮72 h條件下, 地上部中的差異表達(dá)基因的GO富集分析; B: 在低氮72 h條件下, 根系中差異表達(dá)基因的GO富集分析; C: 在低氮72 h條件下, 地上部中的差異表達(dá)基因的KEGG富集分析; D: 在低氮72 h條件下, 根系中的差異表達(dá)基因的KEGG富集分析。

A: GO enrichment analysis of the differentially expressed genes in the shoots after low nitrogen treatment for 72 h; B: GO enrichment analysis of the differentially expressed genes in the roots after low nitrogen treatment for 72 h; C: KEGG enrichment analysis of the differentially expressed genes in the shoots after low nitrogen treatment for 72 h; D: KEGG enrichment analysis of the differentially expressed genes in the roots after low nitrogen treatment for 72 h.

2.4 油菜WRKYs家族基因?qū)Φ偷{迫的表達(dá)反應(yīng)

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物的生物和非生物脅迫、生長發(fā)育以及代謝的響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[32]。甘藍(lán)型油菜全基因組共有287個(gè)WRKYs家族成員[33]。

家族基因主要在根部表達(dá)(圖6-A), 在的差異表達(dá)基因中, 我們主要關(guān)注了(圖6-B)和(圖6-C), 發(fā)現(xiàn)其在受到低氮脅迫時(shí), 根中表達(dá)量均顯著降低。

2.5 油菜MYBs家族基因?qū)Φ偷{迫的表達(dá)反應(yīng)

油菜的MYBs家族基因主要在根部表達(dá)(圖7-A)。在的差異表達(dá)基因主要在根中響應(yīng)缺氮處理。在亞家族受到低氮脅迫時(shí), 根中表達(dá)量顯著降低(圖7-B); 在亞家族受到低氮脅迫時(shí), 根中表達(dá)量基本是降低趨勢(shì), 部分在低氮72 h時(shí)與0 h相比達(dá)到顯著差異(圖7-C)。在亞家族中,(BnaA06g 12700D)在根中的表達(dá)量顯著受低氮脅迫的誘導(dǎo), 其他基因表達(dá)量在低氮72 h后顯著降低(圖7-D), 說明(BnaA06g12700D)可能與其他家族基因功能相反。

2.6 油菜NIAs家族基因?qū)Φ偷{迫的表達(dá)反應(yīng)

NIA轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控硝酸還原酶的過程具有重要作用[34]。甘藍(lán)型油菜的NIAs在葉片的根部均有表達(dá)(圖8-A)。在亞家族中,(BnaA02g18610D)和(BnaA07g33680D)在根中的表達(dá)量受低氮72 h顯著誘導(dǎo),(BnaA07g33690D)在根中和葉片中的表達(dá)量均是在低氮3 h下降, 在低氮72 h上升,(BnaC06g38300D)在根中的表達(dá)量在低氮3 h后下降(圖8-B)。在亞家族中,(BnaA07g20840D)在地上部和根中的表達(dá)量在低氮處理后均受到顯著誘導(dǎo),(BnaC06g 20690D)在根中的表達(dá)量在低氮3 h后下降, 低氮72 h上升(圖8-C)。

圖5 BnaGLNs家族基因的數(shù)字基因表達(dá)譜熱圖

A:s家族基因的總體表達(dá)譜; B:亞家族基因表達(dá)譜; C:亞家族基因表達(dá)譜; D:亞家族基因表達(dá)譜; E:亞家族基因表達(dá)譜; F:亞家族基因表達(dá)譜; G:亞家族基因表達(dá)譜。S0和R0分別表示未做低氮處理的地上部和根; S3和R3分別表示低氮處理3 h后的地上部和根; S72和R72分別表示低氮處理72 h后的地上部和根。差異表達(dá)基因(S3 vs. S0, S72 vs. S0; R3 vs. R0, R72 vs. R0)用星號(hào)標(biāo)注。

A: the total DGE profiling offamily genes; B: the DGE profiling ofsubfamily genes; C: the DGE profiling ofsubfamily genes; D: the DGE profiling ofsubfamily genes; E: the DGE profiling ofsubfamily genes; F: the DGE profiling ofsubfamily genes; G: the DGE profiling ofsubfamily genes. S0 and R0 represent the shoots and roots without low nitrogen treatment, respectively; S3 and R3 indicate the shoots and roots after 3 h of low nitrogen treatment, respectively; S72 and R72 denote the shoots and roots after 72 h of low nitrogen treatment, respectively. The DEGs (S3 vs. S0, S72 vs. S0, R3 vs. R0, and R72 vs. R0) are labelled by asterisks.

圖6 WRKYs家族基因的數(shù)字基因表達(dá)譜熱圖

A: 油菜家族基因的總體表達(dá)譜; B:亞家族基因表達(dá)譜; C:亞家族基因表達(dá)譜。S0和R0分別表示未做低氮處理的地上部和根; S3和R3分別表示低氮處理3 h后的地上部和根; S72和R72分別表示低氮處理72 h后的地上部和根。差異表達(dá)基因(S3 vs. S0, S72 vs. S0; R3 vs. R0, R72 vs. R0)用星號(hào)標(biāo)注。

A: the total DGE profiling offamily genes; B the digital gene expression profiling ofsubfamily genes; C the digital gene expression profiling ofsubfamily genes. S0 and R0 represent the shoots and roots without low nitrogen treatment, respectively; S3 and R3 indicate the shoots and roots after 3 h of low nitrogen treatment, respectively; S72 and R72 denote the shoots and roots after 72 h of low nitrogen treatment, respectively. The DEGs (S3 vs. S0, S72 vs. S0; R3 vs. R0, and R72 vs. R0) are labelled by asterisks.

2.7 油菜NRTs家族基因?qū)Φ偷{迫的表達(dá)反應(yīng)

NRT (nitrate transporter)家族成員在植物體內(nèi)硝酸鹽的吸收和運(yùn)輸中發(fā)揮多功能作用[35-36], 對(duì)植物的生長發(fā)育具有重要意義。其中本文關(guān)注了和的差異表達(dá)基因, 發(fā)現(xiàn)其主要在根中響應(yīng)缺氮處理(圖9-A)。在亞家族中,(BnaA06g04560D)和(BnaA06g04570D)在根中的表達(dá)量在低氮72 h顯著上調(diào)(圖9-B)。在亞家族中,(BnaA02g11760D)和(BnaC02g16150D)受到低氮脅迫3 h和72 h后的表達(dá)量均顯著上升(圖9-C), 這可能與低氮處理后硝酸鹽向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。

2.8 甘藍(lán)型油菜可變剪接鑒定及分析

可變剪接是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性的重要機(jī)制, 是導(dǎo)致真核生物基因和蛋白質(zhì)數(shù)量較大差異的重要原因, 是真核生物中必不可少的過程?？勺兗艚涌梢酝ㄟ^單個(gè)前mRNA不同的剪接方式來增加基因表達(dá)多樣性和蛋白質(zhì)組多樣性[37]。

在低氮處理3 h和72 h后, 地上部和根中均有可變剪接發(fā)生, 具體為外顯子跳躍(SE) 3個(gè), 外顯子選擇性跳躍(MXE) 2個(gè), 其他類型無可變剪接發(fā)生(圖10)。因此低氮處理后, 一些基因可以翻譯出不同的蛋白質(zhì), 進(jìn)而增加其低氮脅迫下系統(tǒng)的復(fù)雜性和適應(yīng)性。

圖7 MYBs家族基因的數(shù)字基因表達(dá)譜熱圖

A: 油菜家族基因的總體表達(dá)譜; B:亞家族基因表達(dá)譜; C:亞家族基因表達(dá)譜; D:亞家族基因表達(dá)譜。S0和R0分別表示未做低氮處理的地上部和根; S3和R3分別表示低氮處理3 h后的地上部和根; S72和R72分別表示低氮處理72 h后的地上部和根。差異表達(dá)基因(S3 vs. S0, S72 vs. S0; R3 vs. R0, R72 vs. R0)用星號(hào)標(biāo)注。

A: the total DGE profiling offamily genes; B: the DGE profiling of; C: the DGE profiling of; D: the DGE profiling ofsubfamily genes. S0 and R0 represent the shoots and roots without low nitrogen treatment, respectively; S3 and R3 indicate the shoots and roots after 3 h of low nitrogen treatment, respectively; S72 and R72 denote the shoots and roots after 72 h of low nitrogen treatment, respectively. The DEGs (S3 vs. S0, S72 vs. S0; R3 vs. R0, and R72 vs. R0) are labelled by asterisks.

3 討論

與谷物不同, 甘藍(lán)型油菜生長發(fā)育過程中對(duì)氮素營養(yǎng)需求相對(duì)較高[4], 盡管它對(duì)氮限制條件極其敏感。國內(nèi)外經(jīng)常施用過量的氮肥以提高作物產(chǎn)量[5]。但由于50%~70%的施用氮不能被作物吸收, 過量施用氮肥必然會(huì)增加作物生產(chǎn)成本, 并導(dǎo)致環(huán)境污染[38], 因此如何在低氮情況下提高油菜NUE仍是當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要內(nèi)容。

圖8 NIAs家族基因的數(shù)字基因表達(dá)譜熱圖

A: 油菜家族基因的總體表達(dá)譜; B:亞家族基因表達(dá)譜; C:亞家族基因表達(dá)譜。S0和R0分別表示未做低氮處理的地上部和根; S3和R3分別表示低氮處理3 h后的地上部和根; S72和R72分別表示低氮處理72 h后的地上部和根。差異表達(dá)基因(S3 vs. S0, S72 vs. S0; R3 vs. R0, R72 vs. R0)用星號(hào)標(biāo)注。

A: the total DGE profiling offamily genes; B: the DGE profiling of; C: the DGE profiling ofsubfamily genes. S0 and R0 represent the shoots and roots without low nitrogen treatment, respectively; S3 and R3 indicate the shoots and roots after 3 h of low nitrogen treatment, respectively; S72 and R72 denote the shoots and roots after 72 h of low nitrogen treatment, respectively. The DEGs (S3 vs. S0, S72 vs. S0; R3 vs. R0, and R72 vs. R0) are labelled by asterisks.

圖9 NRTs 家族基因的數(shù)字基因表達(dá)譜熱圖

A: 油菜和家族基因的總體表達(dá)譜; B:亞家族基因; C:亞家族基因在油菜幼苗地上部和根系中的表達(dá)譜。S0和R0分別表示未做低氮處理的地上部和根; S3和R3分別表示低氮處理3 h后的地上部和根; S72和R72分別表示低氮處理72 h后的地上部和根。差異表達(dá)基因(S3 vs. S0, S72 vs. S0; R3 vs. R0, R72 vs. R0)用星號(hào)標(biāo)注。

A: the total DGE profiling ofandfamily genes; B: the DGE profiling of; C: the DGE profiling ofsubfamily genes. S0 and R0 represent the shoots and roots without low nitrogen treatment, respectively; S3 and R3 indicate the shoots and roots after 3 h of low nitrogen treatment, respectively; S72 and R72 denote the shoots and roots after 72 h of low nitrogen treatment, respectively. The DEGs (S3 vs. S0, S72 vs. S0; R3 vs. R0, and R72 vs. R0) are labelled by asterisks.

(圖10)

A: 在低氮3 h后, 地上部的可變剪接類型及數(shù)量; B: 在低氮72 h后, 地上部的可變剪接類型及數(shù)量; C: 在低氮3 h后, 根的可變剪接類型及數(shù)量; D: 低氮72 h后, 根的可變剪接類型及數(shù)量。JC only表示只使用Junction Counts進(jìn)行AS事件檢測, JC + reads OnTarget表示同時(shí)使用Junction Counts 和 reads on target進(jìn)行AS事件檢測。

A: the type and number of alternative splicing in shoots after 3 h under low nitrogen treatment; B: the type and number of alternative splicing in shoots after 72 h under low nitrogen treatment; C: the type and number of alternative splicing in roots after 3 h under low nitrogen treatment; D: the type and number of alternative splicing in roots after 72 h under low nitrogen treatment. JC only represent that only Junction Counts are used for AS event detection, and JC + reads OnTarget represent that both Junction Counts and reads on target are used for AS event detection.

油菜適應(yīng)氮脅迫的生理生化變化包括生長和光合作用的降低、氮素從根向地上部的轉(zhuǎn)移增加(圖1-A)和氮同化相關(guān)酶活性的改變(圖1-D, E)。而油菜在低氮脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平上, 代謝過程、蛋白結(jié)合、離子結(jié)合、陰離子結(jié)合、分子功能等相關(guān)基因均發(fā)生差異表達(dá)(圖4), 植株可能在面臨低氮脅迫時(shí), 通過改變相關(guān)基因表達(dá), 影響地上地下部的代謝過程, 從而更好地適應(yīng)低氮環(huán)境。此外, 本研究發(fā)現(xiàn), 在氮脅迫下, 油菜的NUE顯著升高(圖1-C), 這表明提高作物品種對(duì)有限氮的適應(yīng)性可能是提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中NUE的有效策略。

與生理數(shù)據(jù)一致, 高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)也揭示, 氮脅迫顯著改變參與硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶相關(guān)的基因的表達(dá)(圖5和圖8)。目前已證明NIA家族的功能是調(diào)控硝酸還原酶[34], GLN家族的功能是調(diào)控谷氨酰胺合成酶[31]。NRT2.1是高親和的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[39], 當(dāng)植株處在低氮條件下時(shí), NRT2.1活性增強(qiáng)(圖9-B), 以適應(yīng)低濃度硝酸鹽條件下對(duì)氮素的吸收, 隨著植株體內(nèi)硝酸鹽含量下降, 硝酸還原酶活性降低, NIA的基因表達(dá)量部分升高, 部分降低(圖8), 可能是由于短時(shí)間內(nèi)的低氮使硝酸還原酶活性降低, 但是由于氮的同化加強(qiáng), 需要更多NH4+, 反向調(diào)節(jié)了NIA的表達(dá)。為滿足植物生長需要, 植株通過調(diào)節(jié)GLNs的表達(dá), 調(diào)節(jié)谷氨酰胺合成酶的活性, 使谷氨酰胺合成酶活性增強(qiáng), 加強(qiáng)氮的同化。

前人研究發(fā)現(xiàn),是番茄灰霉病水楊酸(SA)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)因子, 此外, 還參與氧化還原穩(wěn)態(tài)、水楊酸(SA)信號(hào)、乙烯(ET)-茉莉酸(JA)介導(dǎo)的交叉互作[40]。0在決定SA依賴和JA依賴防御途徑之間的平衡中起著關(guān)鍵作用[41]。前人的研究暗示,和可能在非生物脅迫下存在協(xié)同作用, 本研究利用高通量的數(shù)字基因表達(dá)譜測序, 發(fā)現(xiàn)油菜中和在低氮72 h下的表達(dá)量均顯著下降, 基于這個(gè)結(jié)果, 我們猜測和在氮素利用過程中的調(diào)控機(jī)制發(fā)揮一定作用, 但是其調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

MYB轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物的生物合成[42]。擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子屬于R2R3-MYB家族, 與非生物脅迫反應(yīng)和發(fā)育有關(guān)[42-43]。在擬南芥中,是抑制肉桂酸4-羥化酶(C4H)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄抑制劑, 該基因編碼羥基肉桂酸酯生物合成的關(guān)鍵酶來調(diào)控重要次生代謝物質(zhì)芥子酸酯的生物合成[44]。在擬南芥中迅速能被茉莉酸甲酯(MeJA)快速誘導(dǎo)[45], 并通過直接控制激活SA介導(dǎo)的防御和抑制JA介導(dǎo)的防御來調(diào)節(jié)拮抗相互作用[46]。研究表明,/(HIGH INDOLIC GLUCOSINOLATE1)、/(HIGH INDO LICGLUCOSINOLATE2)和/(ALTERED TRYPTOPHAN REGULATION1)參與了吲哚硫代葡萄糖苷(IG)生物合成的調(diào)控[47-49]。這3個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子在標(biāo)準(zhǔn)生長條件下是IG產(chǎn)生所必需的[50]。在本研究中,和在低氮處理72 h之后, 表達(dá)量均顯著下調(diào)(圖6-C和圖7-C), 研究表明,可以直接調(diào)控[33],基因與其他植物基因在核苷酸和氨基酸水平上具有較高的同源性(80%以上), 同時(shí)在基因結(jié)構(gòu)上與相似[51]。而與同樣具有抗病性[52]。因此, 我們猜測在油菜中和在氮素利用過程中的調(diào)控機(jī)制, 可能與擬南芥的調(diào)控機(jī)制類似, 但是具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

選擇性剪接是導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄組多樣性增加的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄后事件[53], 不少研究表明可變剪接在植物對(duì)非生物脅迫響應(yīng)起重要作用[54-55]。在低氮處理3 h和72 h后, 地上部和根中發(fā)生外顯子跳躍(SE) 3個(gè), 外顯子選擇性跳躍(MXE) 2個(gè), 暗示在低氮條件下, 甘藍(lán)型油菜可以通過可變剪接的發(fā)生來適應(yīng)低氮脅迫。

4 結(jié)論

在低氮脅迫下, 甘藍(lán)型油菜一方面通過調(diào)控將氮資源優(yōu)先分配到地上部, 并通過調(diào)控NR和GS的活性, 來提高油菜的NUE; 另一方面可以通過對(duì)、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及可變剪接的調(diào)控來積極適應(yīng)低氮脅迫。

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Expression profile analysis of low nitrogen stress in

XIAO Yan**, YAO Jun-Yue**, LIU Dong, SONG Hai-Xing, and ZHANG Zhen-Hua*

College of Resource and Environment, Hunan Agricultural University / Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China, Changsha 410128, Hunan, China

The nitrogen fertilizer was overapplied with people’s increased demand for crop yield, but the nitrogen utilization efficiency (NUE) of crops was decreasing. In this study, the differentially expressed genes (DEGs) including the nitrogen absorption, transport, distribution and transcription factors were screened under low nitrogen treatment of 0, 3, and 72 h by the physiological changes and RNA-Seq in rapeseed. The results showed that nitrogen were preferentially allocated to the shoots with the increased glutamine?synthetase (GS) and NUE activities and the decreased nitrate reductase (NR) activity and the total nitrogen concentration under low nitrogen treatment. The analysis of Gene Ontology (GO) enrichment and the Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) metabolic pathway showed that DEGs of the shoots were mainly involved in metabolic process, protein binding, ion binding, and anion binding, while DEGs of the roots were mainly involved in molecular function, primary metabolic process, ion binding, and anion binding. The gene expression profile analysis indicated that after low nitrogen treatment for 72 h, the expression of most genes inincreased; the expression ofandshowed significantly decreased in roots; the expression of most genes in,, anddecreased in the roots; the expression of most genes infamily was up-regulated in roots; and in the subfamily ofand, the expression of(BnaA06g04560D),(BnaA06g04570D),(BnaA02g11760D), and(BnaC02g16150D) increased significantly in roots. At the same time, skipped exon (SE) and mutually exclusive exons (MXE) type occurred in shoots and roots in order to have a better adaptation under low nitrogen stress. In conclusion, the NUE activity was increased by regulating,andgenes, and the,genes and alternative splicing favoredto adapt the low nitrogen stress.

; low nitrogen stress; NO3-; alternative splicing

10.3724/SP.J.1006.2020.94197

本研究由國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFD0200100, 2017YFD0200103)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2017YFD0200100, 2017YFD0200103).

張振華, E-mail: zhzh1468@163.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

肖燕, E-mail: xiaoxiaoY8432@163.com; 姚珺玥, E-mail: yjy950606@126.com

2019-12-16;

2020-04-15;

2020-05-07.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.s.20200506.1831.006.html