火龍果莖植物甾醇對姜黃素納米脂質(zhì)體穩(wěn)定性以及釋放性能的影響

黎雨浩，李照瑩，周 偉,,*，付調(diào)坤，鄒立強(qiáng)，彭盛峰，成 策，劉 偉

（1.南昌大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 湛江 524001）

姜黃素是一種從姜黃中提取的疏水性多酚，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，它具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗血栓等多種保健功能[1]。由于其水溶性低、在胃腸液環(huán)境中穩(wěn)定性差等缺點，導(dǎo)致其口服生物利用度極低[2]，嚴(yán)重限制了姜黃素在食品和制藥工業(yè)中的應(yīng)用。為了提高姜黃素在水中的溶解度、穩(wěn)定性以及生物利用度，目前研究中主要采用脂質(zhì)體、乳液、膠束、納米粒子等多種載體負(fù)載姜黃素。從而改善其理化穩(wěn)定性和生物可接受率[3]。

脂質(zhì)體是由磷脂分子在水相中自組裝形成的雙親性雙層膜球形小泡，由內(nèi)核水相和磷脂雙分子層構(gòu)成。脂質(zhì)體的雙親性使其可運(yùn)載多種親水性或疏水性的營養(yǎng)分子，從而提高其穩(wěn)定性和生物可利用率[4-7]。作為一種研究廣泛的運(yùn)載體系，脂質(zhì)體在藥學(xué)、化妝品和保健食品等不同領(lǐng)域具有非常大的應(yīng)用潛力。研究表明，脂質(zhì)體負(fù)載姜黃素可有效提高其水溶性和理化穩(wěn)定性，從而改善姜黃素在體內(nèi)外消化過程中的接受率[8]。脂質(zhì)體具有諸多優(yōu)勢，如生物相容性、無毒性、生物降解性等[9-10]。然而脂質(zhì)體也有許多缺陷，如在加工、運(yùn)輸和儲存過程中容易發(fā)生聚集，導(dǎo)致藥物泄漏，且其自身穩(wěn)定性較差，容易受到外界環(huán)境的影響，如溫度、鹽離子以及復(fù)雜pH值環(huán)境等[11-12]。近年來，研究者對提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性進(jìn)行大量研究，如Pu Chuanfen等[13]研究表明瓜爾膠能提高姜黃素脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。Tai Kedong等[14]發(fā)現(xiàn)添加β-谷甾醇可以提高姜黃素脂質(zhì)體的穩(wěn)定性以及生物利用度。Li Ziling等[15]發(fā)現(xiàn)采用普朗尼克修飾姜黃素脂質(zhì)體，可以提高其pH值穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。Tian Meiping等[16]采用殼聚糖修飾脂質(zhì)體以改善姜黃素的口服遞送能力。

在傳統(tǒng)脂質(zhì)體的制備過程中，通常會添加一定比例的膽固醇以調(diào)節(jié)膜的流動性，提高磷脂雙分子層的穩(wěn)定性[17-20]。但膽固醇的存在會增加人體冠心病、動脈粥樣硬化等疾病的風(fēng)險。尋找膽固醇的合適替代物優(yōu)化傳統(tǒng)脂質(zhì)體的配方對于擴(kuò)大脂質(zhì)體在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。植物甾醇是一類重要的植物天然活性物質(zhì)，它可以抑制生物體對膽固醇的吸收，影響膽固醇在人體內(nèi)的代謝，抑制膽固醇的生物合成，從而降低心血管疾病的患病概率，此外植物甾醇具有抗炎、抗癌、抗氧化等多種功能[21]。用植物甾醇代替膽固醇作為構(gòu)建脂質(zhì)體的主要膜材料，即可避免膽固醇過多攝入的副作用，還能改善脂質(zhì)體膜的特性，大大提高植物甾醇本身的生物活性[22]。

目前對于植物甾醇脂質(zhì)體的研究較少，特別是使用PSP代替膽固醇制備脂質(zhì)體以運(yùn)載生物活性物質(zhì)的研究鮮有報道。本實驗考察PSP代替膽固醇對姜黃素納米脂質(zhì)體（curcumin-nanoliposomes，NLs-Cur）穩(wěn)定性以及姜黃素體外釋放性能的影響，結(jié)果表明PSP可顯著提高NLs-Cur的穩(wěn)定性，且有更好的緩釋效果。本實驗研究PSP代替膽固醇制備新型脂質(zhì)體運(yùn)載生物活性物質(zhì)，以期為獲得更好穩(wěn)定性和緩釋性的脂質(zhì)體提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PSP由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所采用超聲輔助提取法制備[24-25]，純度達(dá)91.2%；姜黃素（純度98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷脂S75（大豆卵磷脂含磷脂酰膽堿71%和磷脂酰乙醇胺10%）德國Lipoid公司；1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（1,6-diphenylhexa-1,3,5-triene，DPH） 美國Sigma-Aldrich公司；無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

M-700微射流儀 美國Microfluidics公司；RE52-05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮公司；T-6紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；FZ7000熒光光譜儀 日本日立高新技術(shù)公司；Zetasizer Nano ZSP 英國Malvern公司；LUMiFuge穩(wěn)定性分析儀 德國LUM公司。

1.3 方法

1.3.1 火龍果莖植物甾醇姜黃素納米脂質(zhì)體（curcuminphytosterol nanoliposomes，PNLs-Cur）的制備

參照前期研究方法[26]，采用薄膜分散法結(jié)合動態(tài)高壓微 射流（dynamic high pressure microfluidization，DHPM）法制備火龍果莖PNLs-Cur。將磷脂、植物甾醇、姜黃素溶于無水乙醇中，待完全溶解后，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，于真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇形成薄膜，隨即用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS，5 mmol/L，pH 7.0）洗膜獲得粗脂質(zhì)體懸濁液，80 MPa微射流下處理2 次。最終得到的脂質(zhì)體懸濁液中磷脂質(zhì)量濃度為10 mg/mL，姜黃素質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL以及磷脂與PSP不同的質(zhì)量比（10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1）。以不添加PSP的NLs-Cur作為實驗空白。

1.3.2 火龍果莖PNLs-Cur理化性質(zhì)表征

1.3.2.1 粒徑與Zeta電位測定

樣品用PBS（pH 7.0，5 mmol/L）稀釋10 倍，采用Zetasizer Nano ZSP測定平均粒徑、多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）以及Zeta電位。樣品測定前于25 ℃平衡2 min。

該項指標(biāo)的使用方式是每個經(jīng)營年度以全組中考勤最低分作為組內(nèi)所有人在本經(jīng)營年度的考勤得分，采用集體利益掛鉤個人利益的方式進(jìn)行考評。旨在以集體榮譽(yù)感督促、保障全員參與到課程中來，同時讓學(xué)生充分理解系統(tǒng)論中個體與系統(tǒng)的關(guān)系。

1.3.2.2 膜流動性的測定

參考Peng Shengfeng等[27]的測定方法并稍作修改。用DMSO配制2×10―3mol/L的DPH溶液。采用PBS（pH 7.0，5 mmol/L）將200 μL的脂質(zhì)體懸浮液與5 μL DPH溶液稀釋到5 mL，在25 ℃孵育30 min，孵育完成后于激發(fā)波長360 nm、發(fā)射波長430 nm的條件下測定熒光強(qiáng)度。脂質(zhì)體的熒光各向異性（P）由下式計算：

式中：I0,0和I0,90分別為發(fā)射光平行于激發(fā)光和垂直于激發(fā)光的熒光強(qiáng)度；G為光柵校正系數(shù)。

由于各向異性與流動性呈反比，所以膜流動性表示為1/P。

1.3.2.3 PNLs-Cur的穩(wěn)定性分析

參考Tai Kedong等[28]的方法并稍作修改。采用穩(wěn)定性分析儀測定不同環(huán)境條件下PNLs-Cur穩(wěn)定性。將制備好的樣品振蕩均勻，倒入樣品槽中。測定參數(shù)為25 ℃、1 h、掃描間隔10 s、轉(zhuǎn)速4 000 r/min。

新鮮制備的火龍果莖PNLs-Cur以及NLs-Cur，分別調(diào)節(jié)pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0后靜置1 d，再經(jīng)高速分散均勻后，測定其穩(wěn)定性。并用相應(yīng)pH值的去離子水稀釋脂質(zhì)體5 倍，測定其粒徑以及Zeta電位。

新鮮制備的火龍果莖PNLs-Cur以及NLs-Cur，分別調(diào)節(jié)離子濃度至50、100、200、400 mmol/L后靜置1 d，再經(jīng)高速分散均勻后，測定其穩(wěn)定性。并用相同濃度NaCl溶液稀釋脂質(zhì)體5 倍，測定其粒徑以及Zeta電位。

1.3.3 熱穩(wěn)定性

參考Peng Shengfeng等[29]方法并稍作修改。通過測定姜黃素在80 ℃的降解速率評估其在脂質(zhì)體懸浮液中的熱穩(wěn)定性。負(fù)載姜黃素的脂質(zhì)體以體積比1∶4加入PBS（pH 7.0，5 mmol/L）中，以2 mL離心管分裝（每個離心管1 mL樣品），然后將離心管置于80 ℃的水浴中，并以加入適量吐溫80的姜黃素水溶液作為對照。在預(yù)定的時間間隔（0、10、20、30、40、50 min和60 min）中取出離心管并將其置于冰水中冷卻，最后在420 nm波長處測定姜黃素吸光度，根據(jù)姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線計算姜黃素的含量。姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=6.836x+0.029 8，R2=0.999 8，線性范圍為0.2～5 μg/mL。

1.3.4 體外釋放

參考Chen Xing等[30]的測定方法并稍作修改。對2 種脂質(zhì)體釋放性能進(jìn)行評估。取2 mL PNLs-Cur或NLs-Cur懸濁液各3 份，置于透析袋中，將透析袋封口置于50 mL的PBS（含0.5%吐溫80、10%乙醇，pH 7.0）的溶出介質(zhì)中。水浴溫度為37 ℃，于固定的時間間隔（0.5、1、2、4、8、12、24、48、72 h）各取樣2 mL，同時補(bǔ)加2 mL溶出介質(zhì)于420 nm波長處測定姜黃素的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 磷脂與PSP質(zhì)量比對火龍果莖PNLs-Cur的影響

表1 不同質(zhì)量比火龍果莖PNLs-Cur的粒徑、Zeta電位以及PDITable 1 Particle size, zeta potential and PDI of curcuminnanoliposomes with different contents of pitaya stem phytosterol

脂質(zhì)體的穩(wěn)定性通常受其粒徑與Zeta電位影響，研究表明，脂質(zhì)體粒徑越小、電位絕對值越高，脂質(zhì)體越穩(wěn)定[31-32]。如表1所示，磷脂與PSP質(zhì)量比10∶1和8∶1制備PNLs-Cur的平均粒徑分別為（81.99±1. 78）nm和（83.76±1.29）nm，均大于NLs-Cur的平均粒徑（64.81±1.25）nm，而質(zhì)量比為6∶ 1、4∶1與2∶1的PNLs-Cur粒徑顯著（P＜0.05）增大，并且PDI也顯著增加（P＜0.05），植物甾醇作為一類有益的生理活性成分，具有抗癌、抗炎、抗氧化等生理功能，在保持脂質(zhì)體較小尺寸及較佳穩(wěn)定性，選定質(zhì)量比8∶1制備PNLs-Cur。這可能是因為較少量植物甾醇更有助于形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，而較高的植物甾醇摻入量插入導(dǎo)致空間增大。楊貝貝等[33]研究不同含量的大豆植物甾醇含量對脂質(zhì)體粒徑的影響，發(fā)現(xiàn)隨著大豆植物甾醇含量的增加，脂質(zhì)體的粒徑逐漸增大。趙航[34]研究不同含量的混合植物甾醇、β-谷甾醇及豆甾醇對脂質(zhì)體粒徑的影響，發(fā)現(xiàn)隨著植物甾醇的含量增加，脂質(zhì)體的粒徑隨著增大。這與本實驗結(jié)果一致。后續(xù)選擇質(zhì)量比為8∶1分析火龍果莖PNLs-Cur的穩(wěn)定性因素。

結(jié)果表明，所有PNLs-Cur或NLs-Cur間電位都相差不大，說明PSP的摻入對其電位無顯著影響。這是由于甾醇缺乏電荷，脂質(zhì)體的Zeta電位大小主要由卵磷脂決定[28]。

2.2 膜流動性

膜流動性大，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性差，藥物釋放越快[35]，降低膜流動性可以顯著提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和緩釋性。Mora等[36]研究發(fā)現(xiàn)，將甾醇加入膜中可以促進(jìn)甾醇的側(cè)鏈與磷脂酰基鏈的疏水作用和范德華力。Bui等[37]發(fā)現(xiàn)加入膽固醇、羊毛甾醇或其衍生物均可以降低膜流動性，且可改善膜的硬度。Tai Kedong等[14]發(fā)現(xiàn)加入β-谷甾醇均可降低膜流動性，但是磷脂與β-谷甾醇的比例為2∶1時卻沒有降低膜流動性的效果。

PNLs-Cur與NLs-Cur的膜流動性值（1/P）分別為7.06±0.01與10.06±1.14?？梢钥闯黾尤隤NLs-Cur的膜流動性相比于NLs-Cur顯著（P＜0.05）降低，這說明加入PSP的脂質(zhì)體形成了更加致密 的雙層膜，這與其他學(xué)者的結(jié)果一致[37]。

2.3 pH值穩(wěn)定性

表2 pH值對PNLs-Cur的粒徑、表面電荷的影響Table 2 Effect of pH on the surface charge and average particle size of PNLs-Cur

表3 pH值對NLs-Cur的粒徑、表面電荷的影響Table 3 Effect of pH on the surface charge and average particle size of NLs-Cur

由表2、3可以看出，脂質(zhì)體的表面電荷在pH 2時為正，pH 3時為負(fù)，磷脂S75的表面電荷在pH 2～3之間變?yōu)榱悖@與Peng Shengfeng等[27]發(fā)現(xiàn)一致。經(jīng)1 d貯藏后，PNLs-Cur與NLs-Cur在pH 3以及pH 4粒徑都有顯著增大，并且PDI顯著增加，這可能是由于單一磷脂S75制備的姜黃素納米脂質(zhì)體在pH 3以及pH 4的時候聚集，相互之間融合。

圖1 NLs-Cur與PNLs-Cur在不同pH值條件下的透光率曲線Fig. 1 Transmission pro files of NLs-Cur and PNLs-Cur at different pH conditions measured by LUMiFuge

圖2 不同pH值條件下NLs-Cur（A）與PNLs-Cur（B）的不穩(wěn)定性指數(shù)Fig. 2 Instability index curves of NLs-Cur (A) and PNLs-Cur (B)under different pH conditions obtained by software of LUMiFuge

通過LUMiFuge儀器軟件可以獲得一系列時間與空間相關(guān)的投射曲線。紅色曲線表示較早的掃描曲線，綠色為較晚的掃描曲線，曲線變化是由于脂質(zhì)體在離心條件下相互聚集沉積在樣品槽底部，從而導(dǎo)致樣品槽不同部位的透光率發(fā)生變化[38]。由圖1可知，在相同pH值條件下，NLs-Cur的遷移快于PNLs-Cur。通過不穩(wěn)定性指數(shù)曲線分析（圖2），可更好地說明在離心條件下PNLs-Cur以及NLs-Cur穩(wěn)定性差異[38]，這表明在相同pH值條件下PNLs-Cur的不穩(wěn)定性指數(shù)均小于NLs-Cur。這是可能是因為PSP的存在使得脂質(zhì)體的膜結(jié)構(gòu)變得更加穩(wěn)定。

2.4 離子穩(wěn)定性

表4 離子強(qiáng)度對PNLs-Cur粒徑、表面電荷的影響Table 4 Effect of the ionic strength on the surface charge and average particle size of PNLs-Cur

表5 離子強(qiáng)度對NLs-Cur粒徑、表面電荷的影響Table 5 Effect of ionic strength on the surface charge and average particle size of NLs-Cur

由表4、5可知，隨著NaCl濃度的增加，脂質(zhì)體的Zeta電位絕對值均相應(yīng)減小，這可能是因為NaCl的靜電屏蔽作用[39]。Peng Shengfeng等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，磷脂S75構(gòu)建的脂質(zhì)體在不同的NaCl濃度下的粒徑變化不大，這與本實驗結(jié)果一致。且發(fā)現(xiàn)隨著NaCl濃度上升，脂質(zhì)體的平均粒徑會呈先略微上升再下降的趨勢，這可能是因為脂質(zhì)體膜上的離子梯度導(dǎo)致水分從其內(nèi)部流出[39-40]。

圖3 NLs-Cur與PNLs-Cur在不同離子強(qiáng)度條件下的透光率曲線Fig. 3 Transmission pro files of NLs-Cur and PNLs-Cur under different ionic strength conditions measured by LUMiFuge

由圖3、4可知，在0～200 mmol/L的NaCl濃度之間，PNLs-Cur的穩(wěn)定性顯著優(yōu)于NLs-Cur，不穩(wěn)定性指數(shù)可以得出，PNLs-Cur不穩(wěn)定性指數(shù)均小于NLs-Cur，說明PNLs-Cur在相同離子濃度條件下的穩(wěn)定性好于NLs-Cur。

圖4 NLs-Cur（A）與PNLs-Cur（B）在不同離子強(qiáng)度條件下的不穩(wěn)定性指數(shù)Fig. 4 Instability index curves of NLs-Cur (A) and PNLs-Cur (B)under different ionic strength conditions obtained by software of LUMiFuge

2.5 熱穩(wěn)定性實驗結(jié)果

圖5 PNLs-Cur與NLs-Cur在80 ℃姜黃素的降解率Fig. 5 Degradation rates of curcumin in PNLs-Cur and NLs-Cur at 80 ℃ within 60 min

脂質(zhì)體的熱穩(wěn)定性是評價其在加工和應(yīng)用過程中的一個重要指標(biāo)，因此評價了PSP對NLs-Cur熱穩(wěn)定性的影響[15]。如圖5所示，在80 ℃的處理下，前10 min姜黃素的降解較快，PNLs-Cur與NLs-Cur分別下降了17.61%和21.4%，而此后姜黃素降解逐漸變緩，這與Li Ziling等[15]的研究結(jié)論一致。姜黃素在PBS中降解速率非?？欤?0 min已經(jīng)降解46.1%。處理60 min后，PNLs-Cur和NLs-Cur的姜黃素保留率分別為61.25%和57.48%，而姜黃素溶液保留率顯著（P＜0.05）低于P NLs-Cur與NLs-Cur，僅為17.21%。證明將姜黃素包埋在脂質(zhì)體中可以有效提高其熱穩(wěn)定性，這與Tai Kedong等[14]的研究結(jié)論一致。比較PNLs-Cur和NLs-Cur對保留率，說明PSP的存在顯著（P＜0.05）延長了姜黃素在高溫條件下的降解數(shù)量，PNLs-Cur表現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性。

2.6 體外釋放實驗結(jié)果

圖6 NLs-Cur和PNLs-Cur 的體外釋放曲線Fig. 6 In vitro release curves of NLs-Cur and PNLs-Cur

通過對NLs-Cur體外釋放行為的研究對其體內(nèi)性能具有重要的意義，有助于評價姜黃素的緩釋行為[15]。如圖6所示，NLs-Cur與PNLs-Cur初始釋放較快，隨后釋放減緩，這與Yingyuad等[41]研究結(jié)果相似。PNLs-Cur在72 h的累計釋放率為50.08%，而NLs-Cur為63.64%。Kaddah等[42]發(fā)現(xiàn)，加入膽固醇后，羅丹明B的釋放量顯著下降。Tai Kedong等[14]報道了添加β-谷甾醇顯著降低了姜黃素在納米脂質(zhì)體中的累計釋放速率，并且隨著β-谷甾醇的增加，累計釋放速率隨之降低。這說明PSP的存在可以顯著（P＜0.05）減緩NLs-Cur的釋放速率，其原因可能是PSP與磷脂的相互作用使得脂質(zhì)體的雙層膜更加致密，從而降低姜黃素的滲透率。

3 結(jié) 論

本實驗利用PSP替代膽固醇修飾NLs-Cur，以提高其理化穩(wěn)定性和姜黃素的緩釋性。通過對粒徑、電位等指標(biāo)的考察，發(fā)現(xiàn)PSP可使NLs-Cur粒徑顯著增大，當(dāng)磷脂與PSP的比例為8∶1時，其制備PNLs-Cur的平均粒徑為（83.76±1.29）nm，Zeta電位為（－11.0±1.06）mV，PDI為0.30±0.002，各項指標(biāo)較為理想；穩(wěn)定性實驗表明，相同條件下發(fā)現(xiàn)PNLs-Cur的不穩(wěn)定性指數(shù)更小，即PSP可改善NLs-Cur的離子和pH值穩(wěn)定性。此外，PNLs-Cur具有更好的熱穩(wěn)定性，80 ℃處理60 min后姜黃素的保留率更高。體外釋放結(jié)果表明，PSP可以顯著提高NLs-Cur的緩釋特性。因此，本研究可為采用PSP代替膽固醇，制備更 加穩(wěn)定的無膽固醇脂質(zhì)體載體提供一定的理論指導(dǎo)，對火龍果莖副產(chǎn)物的綜合利用具有一定的應(yīng)用啟發(fā)。