花生中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的提取及含量測(cè)定

郝旭晨 董燕婕 范麗霞 苑學(xué)霞 梁京蕓 王磊 李大鵬 趙善倉(cāng)

摘要：建立高效液相色譜紫外法同時(shí)測(cè)定花生中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量的方法。以85%乙醇水溶液為提取劑，采用直接超聲提取、高速勻漿提取和固相萃取3種不同提取方法處理花生樣品，對(duì)提取劑使用量和提取方法進(jìn)行比較研究，高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明：當(dāng)提取劑使用量為40mL時(shí)，固相萃取提取法效果最好，白藜蘆醇的加標(biāo)回收率為9600%～10955%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為164%～217%，檢出限為0016mg/kg;白藜蘆醇苷的加標(biāo)回收率為9182%～10467%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為173%～281%，檢出限為0052mg/kg。測(cè)定的山東省210個(gè)花生樣品中白藜蘆醇含量為017～1139mg/kg，含量最低的是花育22，最高的是白玉品種;白藜蘆醇苷含量為022～144mg/kg，含量最低的是春甜，最高的是山花9號(hào)品種。該方法適合于花生樣品中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：花生;白藜蘆醇;白藜蘆醇苷;高效液相色譜法

白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物，主要存在于葡萄、花生、虎杖等植物中[1]。白藜蘆醇苷，又稱虎杖苷，是從蓼屬植物虎杖根中提取的一種多酚類物質(zhì)，化學(xué)名稱為3，4，5三羥基芪3βD葡萄糖苷，苷元為白藜蘆醇，糖部分為單D葡萄糖。白藜蘆醇分子中的羥基與葡萄糖結(jié)合而形成白藜蘆醇苷。研究表明，白藜蘆醇苷具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、減輕多種因素造成的組織器官損傷、保護(hù)肝細(xì)胞、降血脂等作用[2]。白藜蘆醇苷和白藜蘆醇具有相似的生物活性，白藜蘆醇苷可在體內(nèi)代謝為白藜蘆醇[34]，在腸道中糖苷酶的作用下分離出白藜蘆醇[57]。

花生是我國(guó)主要的油料作物，富含白藜蘆醇以及白藜蘆醇苷等營(yíng)養(yǎng)功能成分。高效液相色譜（HPLC）法具有高靈敏度、高效能和高速度的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于葡萄酒、虎杖、花生等樣品中白藜蘆醇的檢測(cè)[811]。韓寒冰等[12]研究珍珠紅14、粵油114、汕油523和湛油75等花生品種的廢棄物中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量，為花生廢棄物的綜合利用提供了科學(xué)依據(jù)。目前同時(shí)提取和測(cè)定白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的研究也主要集中在虎杖、葡萄、葡萄酒和桑椹等[1315]。楊潤(rùn)濤等[16]同時(shí)測(cè)定了血漿中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量。禹珊等[17]同時(shí)測(cè)定了中藥虎杖中白藜蘆醇和虎杖苷的含量。HPLC法測(cè)定白藜蘆醇的含量，樣品前處理方法的不同將直接影響測(cè)定結(jié)果[18]。白藜蘆醇難溶于水，易溶于乙醚、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑[1920]，對(duì)白藜蘆醇的提取率由低到高依次為丙酮<無水乙醇<甲醇<乙醚<乙酸乙酯，因?yàn)橐掖季哂袩o毒、安全、價(jià)格低廉、易得、易回收的特點(diǎn)[21]，大多選擇乙醇作為提取白藜蘆醇的試劑較適宜。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)，對(duì)于同時(shí)檢測(cè)花生中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量還未有相關(guān)的研究性試驗(yàn)。本研究參照GB/T 24903—2010標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)化前處理方法，對(duì)花生中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，以建立提取效果好、回收率高、重復(fù)性好的檢測(cè)方法。

1材料與方法

11試劑

白藜蘆醇，純度≥98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院;白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司;乙腈（色譜純）;無水乙醇（分析純）;氧化鋁分層柱（0074～0149mm）;娃哈哈純凈水;022μm有機(jī)濾膜。

12儀器

Waters2695高效液相色譜儀，儀器配Waters 2998光電二極管陣列檢測(cè)器;IKA MS3 digital渦旋儀;Sigma 3K15醫(yī)用離心機(jī);美國(guó)NEVAP111氮吹濃縮儀;KQ800DE超聲儀。

13方法

131標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制分別稱取白藜蘆醇和白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)品各125mg（精確至0000 1g）置于250mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為50mg/L的白藜蘆醇、白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存于4℃。臨用時(shí)，用甲醇稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液[22]。

132標(biāo)準(zhǔn)工作液系列的配制甲醇稀釋白藜蘆醇和白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)貯備液得到005、01、05、10、20、50、100mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

133樣品前處理方法

（1）直接超聲提取法。稱取250g花生粉狀樣品于50mL離心管中，加入85%乙醇水溶液25mL，置于80℃超聲儀中水浴超聲25min，冷卻后于5 000r/min離心5min，殘?jiān)儆?5mL 85%乙醇水溶液再次提取，充分渦旋混勻1min，重復(fù)以上超聲離心步驟，合并提取液，渦旋混勻。吸取2mL上清液，過022μm有機(jī)濾膜待用[23]。

（2）高速勻漿提取法。稱取25g花生粉狀樣品于50mL離心管中，加入85%乙醇水溶液10mL高速勻漿2min后，于4 000r/min離心10min。將上清液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中。殘?jiān)謩e用20mL 85%乙醇水溶液提取2次后合并提取液，定容。搖勻后用022μm濾膜過濾，待用[24]。

（3）固相萃取法。稱取50g花生粉狀樣品于50mL離心管中，加入85%乙醇水溶液40mL于80℃超聲水浴45min，不時(shí)振搖。靜置過夜后吸取8mL上清液過氧化鋁層析柱，收集濾液到10mL刻度管。40℃氮吹濾液至1mL，用022μm濾膜過濾，待用[22]。

134高效液相色譜條件色譜柱條件為TnatureC8色譜柱（46mm×250mm，5μm）;柱溫為25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為306nm;流動(dòng)相A為900μL冰醋酸+1 000mL水;流動(dòng)相B為乙腈;進(jìn)樣量為10μL;檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器（表1）。

2結(jié)果與分析

21標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，對(duì)不同濃度梯度的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品和白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)品分別作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，白藜蘆醇及白藜蘆醇苷混標(biāo)在質(zhì)量濃度為005～10mg/L時(shí)，質(zhì)量濃度（C，mg/L）與其峰面積（A）呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0999（表2）。

24方法重復(fù)性和準(zhǔn)確度比較

在花生粉碎樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10、50、100mg/kg。每個(gè)濃度水平重復(fù)5次，分別按照步驟“121、122、123” 3種前處理方法處理樣品，進(jìn)行精密度與準(zhǔn)確度的測(cè)定，3種添加濃度的方法重復(fù)性及回收率列于表4。

3討論與結(jié)論

目前，研究白藜蘆醇苷提取的材料是虎杖[2526]和葡萄[2729]。但對(duì)花生生產(chǎn)中白藜蘆醇苷的檢測(cè)未見報(bào)道。本研究比較了3種花生樣品前處理方法的LOD、LOQ、回收率以及精密度，結(jié)果表明，固相萃取法的回收率高于高速勻漿提取法和直接超聲提取法，而且溶劑的使用量低。溶劑直接提取法提取試劑消耗量大，且提取效率不高。高速離心法的提取率略低于固相萃取柱，存在試劑消耗、提取不完全的問題。固相萃取法采用樣品提取后靜置過夜，使白藜蘆醇以及白藜蘆醇苷與萃取劑充分接觸，提高萃取效率。固相萃取柱中含有氧化鋁成分，吸附樣品基質(zhì)中的偏極性化合物，可以將白藜蘆醇和白藜蘆醇苷與花生樣品中的其他雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)有效分離。

采用固相萃取法在獲得最佳凈化效果的同時(shí)可得到最佳的回收率，優(yōu)于高速勻漿提取法和直接超聲提取法，白藜蘆醇的加標(biāo)回收率為9600%～10955%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為164%～217%;白藜蘆醇苷的加標(biāo)回收率為9182%～10467%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為173%～281%。測(cè)定的山東省210個(gè)花生樣品中白藜蘆醇含量為017～1139mg/kg，含量最低的是花育22，最高的是白玉品種;白藜蘆醇苷含量為022～144mg/kg，含量最低的是春甜，最高的是山花9號(hào)品種。◇

參考文獻(xiàn)

[1]姜德志，程水源，王燕，等羅田3個(gè)板栗栽培品種主要營(yíng)養(yǎng)成分分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（23）：48824884

[2]高守紅，楊少麟，范國(guó)榮虎杖苷的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2005，23（3）：145147

[3]Yu C，Shin Y G，Chow A，et alHuman，rat，and mouse metabolism of resveratrol[J]Pharmaceutical Research，2002，19（12）：19071914

[4]MaierSalamon A，Hagenauer B，Wirth M，et alIncreased transport of resveratrol across monolayers of the human intestinal caco2 Cells is mediated by inhibition and saturation of metabolites[J].Pharmaceutical Research，2006，23（9）：21072115

[5]舒友琴，等葡萄酒中白藜蘆醇及其糖苷異構(gòu)體的快速測(cè)定方法研究[D]北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004

[6]王俏先，亢壽海，張琴酚，等白藜蘆醇苷的抗癌作用及對(duì)癌細(xì)胞周期的影響[J]浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2003，13（5）：287288

[7]朱立賢，等白藜蘆醇苷對(duì)高血脂癥大鼠血脂代謝的影響及其抗氧化作用[J].中成藥，2006，28（2）：260261

[8]張烜，胡君萍，韓玫，等HPLC法測(cè)定花生不同部位中白藜蘆醇的含量[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26（5）：440441

[9]王琴飛，應(yīng)東山，洪彩香，等HPLC測(cè)定黃曲霉菌侵染后花生種子中6種芪化物[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2013，35（4）：428435

[10]侯建波，謝文，史穎珠，等高效液相色譜法測(cè)定進(jìn)口葡萄酒中的白藜蘆醇及其甙[J].理化檢驗(yàn)（化學(xué)分冊(cè)），2015，51（7）：938942

[11]周雅琴，樊溪源，周小雷，等不同產(chǎn)地虎杖中白藜蘆醇與白藜蘆醇苷含量測(cè)定[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31（5）：632634

[12]韓寒冰，沈蘭，李海航花生廢棄物中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的提取與分析[J].華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014（1）：4650

[13]劉仁旺，滕增輝，張邦樂，等虎杖中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的提取及含量測(cè)定[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29（3）：197199

[14]Huang X，Mazza GSimultaneous analysis of serotonin，melatonin，piceid and resveratrol in fruits using liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2011，1218（2）：38903899

[15]Benova B，Adam M，Pavlikova P，et alSupercritical fluid extraction of piceid，resveratrol and emodin from Japanese knotweed[J].The Journal of Supercritical Fluids，2010，51（3）：325330

[16]楊潤(rùn)濤，周四元，章翔，等液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定血漿中白藜蘆醇苷及其代謝產(chǎn)物[J].分析化學(xué)，2007，35（9）：13091313

[17]禹珊，郭強(qiáng)勝，王會(huì)琳，等定量核磁共振波譜法同時(shí)測(cè)定中藥虎杖中白藜蘆醇和虎杖苷的含量[J].分析化學(xué)，2015，43（1）：6974

[18]姜瑞清，等白藜蘆醇分離純化及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].中藥材，2007，30（3）：367371

[19]黃衛(wèi)文，黃壽恩，黎繼烈，等白藜蘆醇的提取檢測(cè)技術(shù)及其生物活性研究進(jìn)展[J].食品與機(jī)械，2010，26（6）：148152

[20]單輝君，張名位，張瑞芬，等花生根中自藜蘆醇提取工藝的優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2008，39（2）：9397

[21]李燕，等白藜蘆醇提取及分離純化研究進(jìn)展[J].糧食與油脂，2009（5）：3741

[22]劉 煒，丁小霞，李培武，等花生中白藜蘆醇含量測(cè)定的前處理方法優(yōu)化[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（10）：16951697

[23]南京財(cái)經(jīng)大學(xué)，江南大學(xué)GB/T 24903—2010糧油檢驗(yàn)花生中白藜蘆醇的測(cè)定高效液相的色譜法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010

[24]四川省農(nóng)科院分析測(cè)試中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（成都）NY/T 2641—2014植物源性食品中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的測(cè)定高效液相色譜法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014

[25]張建超，高新周，易德亮虎杖中白藜蘆醇苷提取分離工藝研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2003，14（4）：2931

[26]陳易彬，孫寶祥，陳佳希虎杖中白藜蘆醇的穩(wěn)定性研究[J].中藥材，2007，30（7）：805807

[27]陳雷，韓雅珊葡萄不同品種和組織白藜蘆醇含量的差異[J].園藝學(xué)報(bào)，1999，26（2）：2529

[28]劉竹蘭，張楠，崔哲，等紫外光對(duì)葡萄皮中白藜蘆醇的誘導(dǎo)作用[J].食品科學(xué)，2008，29（5）：142144

[29]冀劍霜，張美玲，錢偉斌，等葡萄原料對(duì)干紅葡萄酒品質(zhì)及白藜蘆醇含量的影響[J].中國(guó)釀造，2010（11）：149152