宏基因組測(cè)序法檢測(cè)市售益生菌產(chǎn)品的菌種組成

曹淑曼 王雪涵 田薇

摘要：目的：通過(guò)微生物宏基因組測(cè)序方法檢測(cè)10種市售益生菌產(chǎn)品的菌種組成。方法：從益生菌產(chǎn)品中直接提取微生物宏基因組DNA，采用第二代高通量基因測(cè)序方法進(jìn)行宏基因組測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確定每種產(chǎn)品中益生菌的菌種組成以及相對(duì)豐度。結(jié)果：所檢測(cè)的10種產(chǎn)品中，僅有2種產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果與產(chǎn)品說(shuō)明中所標(biāo)注的菌種組成完全相符，其他產(chǎn)品均與各自標(biāo)注有不符合之處，主要表現(xiàn)為菌種缺失或（和）含有其他混雜菌種。兩次獨(dú)立抽樣檢測(cè)結(jié)果一致。結(jié)論：監(jiān)管部門需要對(duì)益生菌產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)控，而微生物宏基因組測(cè)序技術(shù)為監(jiān)管部門提供了一個(gè)檢測(cè)益生菌產(chǎn)品菌種組成的新方法。

關(guān)鍵詞：益生菌;宏基因組;菌種組成

人體健康與人體共生的各種微生物密切相關(guān)，益生菌通過(guò)四個(gè)主要機(jī)制對(duì)人體產(chǎn)生有益的影響[1]：通過(guò)結(jié)合在粘附位點(diǎn)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)來(lái)干擾病原菌的定殖[2];改善腸道上皮細(xì)胞的屏障功能[3];參與免疫調(diào)節(jié)[4];通過(guò)免疫系統(tǒng)[5]和神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生對(duì)身體其他器官的影響[如γ氨基丁酸（GABA）和5羥色胺][6]。市場(chǎng)上常見(jiàn)的益生菌主要包括雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的微生物群。例如，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）GG ATCC 53103可促進(jìn)微生物群的關(guān)鍵成分與宿主上皮之間的相互作用，潛在地促進(jìn)了腸道定居微生物的抗炎通路[7]，從而改善腸道微環(huán)境;長(zhǎng)雙歧桿菌可促進(jìn)抗腫瘤免疫并加強(qiáng)抗PDL1的功效[8]。益生菌的功能具有種屬特異性和個(gè)體差異性，即使屬于同一菌種的不同菌株，也會(huì)有功效的差異。例如，假鏈狀雙歧桿菌（Bifidobacterium pseudocatenulatum）CECT 7765能夠有益地調(diào)節(jié)慢性應(yīng)激反應(yīng)[9]，假鏈狀雙歧桿菌IPLA 36007有益于異黃酮活化[10]，而假鏈狀雙歧桿菌G4可以抑制血膽固醇的增加[11]。因此，益生菌菌種乃至菌株的正確使用是益生菌產(chǎn)品發(fā)揮功能的最重要的一環(huán)。

除了傳統(tǒng)上用于食品生產(chǎn)加工的菌種外，原衛(wèi)生部辦公廳發(fā)布的《可用于食品的菌種名單》和《可用于嬰幼兒食品的菌種名單》中，列出了7個(gè)菌屬共計(jì)35個(gè)益生菌菌種可用于食品[1217]。市場(chǎng)上的益生菌產(chǎn)品所使用的菌株應(yīng)當(dāng)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，并且應(yīng)當(dāng)標(biāo)注明確到具體的菌株。目前鑒定益生菌的方法大多限于傳統(tǒng)方法和比較粗放的分子生物學(xué)方法，如平板稀釋計(jì)數(shù)法、顯微鏡測(cè)數(shù)法、濁度測(cè)定法、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法。平板菌落計(jì)數(shù)法[18]是最經(jīng)典的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法，需要培養(yǎng)活菌，操作簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定，但只能從菌落的形態(tài)、顏色等方面初步辨別真菌與細(xì)菌。顯微鏡測(cè)數(shù)法[19]是利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里微生物的數(shù)量，快速、準(zhǔn)確，但不能區(qū)分死菌或活菌，不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)，需要較高的細(xì)菌濃度，且僅能根據(jù)染色后顏色和形態(tài)等對(duì)細(xì)菌做大致的分類。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法[2021]也能夠一定程度上鑒定細(xì)菌，但是無(wú)法鑒定到種水平。16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序[2223]既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測(cè)序技術(shù)較容易地得到其序列，但有的菌種由于屬內(nèi)/種間差異小，單獨(dú)依靠16SrDNA鑒定不能鑒定到種水平。Patro等[24]構(gòu)建了一個(gè)名為FDA GutProbe高效可靠的平臺(tái)，使用DNA微陣列芯片法鑒定膳食補(bǔ)充劑中微生物成分的存在并確定其差異。但這些常用的方法只是定量測(cè)定細(xì)胞濃度的方法，無(wú)法對(duì)微生物進(jìn)行物種的鑒定，這是傳統(tǒng)方法的局限性。

宏基因組測(cè)序[25]可分析特定環(huán)境微生物群體基因組成及功能、菌群的多樣性與豐度，可以鑒定出混合環(huán)境中包含有哪些菌株，精度可鑒定到菌株水平。Patro等[26]運(yùn)用宏基因組測(cè)序技術(shù)鑒定膳食補(bǔ)充劑樣品中微生物活菌，用kmer方法計(jì)算其豐度，可快速有效地識(shí)別各種膳食補(bǔ)充劑樣品中物種水平，確定這些產(chǎn)品中特定污染物的存在。因此，宏基因組測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)益生菌產(chǎn)品的菌株組成有其不可替代的優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)采用宏基因組測(cè)序技術(shù)，分析市售10種益生菌產(chǎn)品的菌種組成，為我國(guó)益生菌產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控探索一種新方法。

1材料與方法

11主要試劑與儀器

天根糞便基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司;柏爾快速建庫(kù)試劑盒（貨號(hào)：514402）;Ampure XP磁珠，Beckman公司;微量核酸定量?jī)x（ND1000 型），美國(guó)Nano Drop 公司;PCR 儀（2720 型），美國(guó) Applied Biosystems 公司;電泳儀（PowerpacTM基礎(chǔ)型），美國(guó) BIORAD 公司;凝膠成像系統(tǒng)（Alpha Imager EP通用型），美國(guó) Alpha Innotech 公司;離心機(jī)（Z216 MK 型），德國(guó) HERMLE 公司;超聲破碎儀（Bioruptor）;Mini Bead beater16（607EUR型），購(gòu)于美國(guó)BioSpec公司。

12益生菌產(chǎn)品和微生物基因組DNA提取

從京東商城采購(gòu)10 種市面上常見(jiàn)的益生菌產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)時(shí)產(chǎn)品均在保質(zhì)期范圍內(nèi)。對(duì)于10種產(chǎn)品，均于同一批次內(nèi)分別隨機(jī)抽取2份獨(dú)立小包裝，作為實(shí)驗(yàn)重復(fù)。使用天根糞便基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提?。悍Q?。?00±5） mg益生菌產(chǎn)品干粉至2 mL離心管中，置于冰上。稱取03 g直徑01 mm 的玻璃珠，向樣本中加入14 mL緩沖液GSL，用bead beater 振蕩2 min。用95 ℃、900 r/min振蕩孵育10 min。渦旋15 s。12 000 r/min離心1 min。然后按照天根糞便基因組DNA提取試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行DNA提取。DNA 提取結(jié)果用 1% 瓊脂糖凝膠電泳100 V、60 min，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

13微生物DNA濃度檢測(cè)

使用Nano Drop核酸濃度測(cè)定儀，按照使用說(shuō)明書，分別取以上益生菌產(chǎn)品提取得到的DNA 洗脫液 1 μL 加樣于檢測(cè)區(qū)，讀取DNA的濃度。濃度要求不少于10 ng/μL。

14測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建及質(zhì)控

取20 μg微生物宏基因組DNA，使用柏爾快速建庫(kù)試劑盒構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。具體步驟如下：取檢測(cè)合格的20 μg DNA樣品，用Bioruptor儀器隨機(jī)打斷成長(zhǎng)度約為350 bp的片段，再用磁珠純化，經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測(cè)序接頭、純化、PCR 擴(kuò)增等步驟完成整個(gè)文庫(kù)制備。文庫(kù)構(gòu)建完成后，使用Qubit 20進(jìn)行初步定量，稀釋文庫(kù)至2 ng/μL，隨后使用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的插入片段大小進(jìn)行檢測(cè)，使用qPCR方法[27]對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫(kù)有效濃度>3 mmol/L），以保證文庫(kù)上機(jī)質(zhì)量。

15測(cè)序

將構(gòu)建好的文庫(kù)在Illumina Hiseq 2500平臺(tái)上機(jī)進(jìn)行測(cè)序。

16物種注釋

使用MOCAT[28]預(yù)處理過(guò)濾低質(zhì)量序列、過(guò)短序列以及錯(cuò)誤序列，得到有效數(shù)據(jù)。從各樣品質(zhì)控后的有效數(shù)據(jù)出發(fā)，進(jìn)行Metagenome組裝[29]。從gene catalogue出發(fā)，用bowtie把序列和MicroNR庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得Unigenes的物種注釋信息，并結(jié)合基因豐度表，獲得不同分類層級(jí)的物種豐度表。

2結(jié)果與分析

21所檢測(cè)到的菌株總覽

根據(jù)Metagenomic測(cè)序生成的進(jìn)化分支圖，本次檢測(cè)的益生菌產(chǎn)品中所測(cè)出的菌株，分屬于11個(gè)科、11個(gè)屬、22個(gè)種，其中益生菌集中在2個(gè)屬—雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus），其他益生菌還包括鏈球菌屬（Streptococcus）。腸桿菌屬、腸球菌屬、分枝桿菌屬等為產(chǎn)品中痕量的微生物污染。

22所檢測(cè)到的菌種與產(chǎn)品說(shuō)明的對(duì)比

在市場(chǎng)上所隨機(jī)抽取的10種益生菌產(chǎn)品名稱以字母代號(hào)表示。如附圖所示，所檢測(cè)的10種益生菌產(chǎn)品中，只有代號(hào)為TCBJ和DMKHS的兩個(gè)產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果和產(chǎn)品標(biāo)注完全相同，且兩次抽檢檢測(cè)到的菌種組成完全一致。其他產(chǎn)品均不達(dá)標(biāo)，表現(xiàn)為缺失產(chǎn)品說(shuō)明中所列示的菌種，或者含有產(chǎn)品說(shuō)明中未標(biāo)示的菌種。10種益生菌產(chǎn)品中，菌種組成的合格率僅為20%。

23分析

市場(chǎng)上的益生菌產(chǎn)品主要包括乳制品、粉劑、片劑等，本次實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)品主要是粉劑、片劑、膠囊，近年來(lái)這些產(chǎn)品作為補(bǔ)充身體益生菌的主要膳食補(bǔ)充劑而廣受推崇。10種市售的益生菌產(chǎn)品中的菌種大多屬于乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬，其中用的最常見(jiàn)的是嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis）。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)宏基因組測(cè)序檢測(cè)出最多的菌種是鼠李糖乳桿菌（Lctobacillus rhamnosus）和動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）?？傮w上，本次檢測(cè)的產(chǎn)品存在較為突出的問(wèn)題，10個(gè)產(chǎn)品平均有1～2個(gè)標(biāo)注的益生菌種未檢測(cè)到，其中代號(hào)為HSYP的產(chǎn)品標(biāo)注為嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus），而檢測(cè)到的全部為瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）;所有產(chǎn)品包裝都沒(méi)有標(biāo)注的菌種玉米乳桿菌（Lactobacillus zeae）在兩個(gè)產(chǎn)品中檢測(cè)到，且在BSY中為主要益生菌組分;個(gè)別產(chǎn)品（代號(hào)BSY）益生菌沒(méi)有污染的雜菌豐度高，兩次重復(fù)測(cè)定中益生菌比例僅占285%～32%。部分非產(chǎn)品標(biāo)注的乳酸菌的出現(xiàn)，可能是由于生產(chǎn)企業(yè)為了延長(zhǎng)保質(zhì)期限，將某些可以產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸菌如副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum ）等作為食品添加劑導(dǎo)致的[30]。中國(guó)目前市場(chǎng)流通的益生菌產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，生產(chǎn)企業(yè)對(duì)微生物的菌種鑒定水平與生產(chǎn)管理水平亟待提高。

3結(jié)論

使用宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)我國(guó)益生菌產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，益生菌產(chǎn)品市場(chǎng)存在著不規(guī)范和安全隱患的問(wèn)題，可以利用高通量測(cè)序的新技術(shù)來(lái)對(duì)國(guó)內(nèi)益生菌產(chǎn)品市場(chǎng)進(jìn)行監(jiān)管。益生菌廠家生產(chǎn)時(shí)應(yīng)使用符合國(guó)標(biāo)的具有明確編號(hào)的菌株，保證生產(chǎn)、包裝環(huán)境無(wú)菌，保證消費(fèi)者的權(quán)益?！?/p>

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