水相體系中Amadori 化合物的合成及檢測方法研究

李 碩， 張 建， 張連富*，，3

（1. 江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122；2. 石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子832003；3. 北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京100048）

美拉德反應(yīng)是含氨基的化合物與含有羰基的化合物之間發(fā)生的一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，最終生成棕色或黑色的大分子物質(zhì)類黑精[1]。 一般認(rèn)為美拉德反應(yīng)可以分為初級(jí)、中級(jí)、高級(jí)3個(gè)階段，而阿瑪多利化合物（Amadori Compounds，ACs）為其初級(jí)反應(yīng)所形成的穩(wěn)定產(chǎn)物[2]。 ACs 純品一般為白色或黃色的固體，易溶于水和甲醇，本身沒有氣味，但卻是重要的非揮發(fā)性香味前體物質(zhì)[3]。 美拉德反應(yīng)普遍存在于食品的加工、儲(chǔ)藏與烹飪過程中，對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味、色澤、口感等有著重要影響[4]。 余佳浩等[5]研究表明，ACs 可以有效抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性，從而有效抑制心腦血管疾病產(chǎn)生。 此外，ACs 還可以有效清除化學(xué)體系中活性氧自由基[6]。 而美拉德反應(yīng)中后期產(chǎn)物雖然對(duì)食品的風(fēng)味、色澤等有重要作用，但同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生一些有害物質(zhì)，例如糖基化最終產(chǎn)物AGEs，過量的AGEs 積累會(huì)導(dǎo)致一些慢性病的發(fā)生[7-8]，因此調(diào)控美拉德反應(yīng)的進(jìn)程尤為重要。

作者前期已經(jīng)成功在有機(jī)相中合成了8種ACs， 并利用液質(zhì)聯(lián)用的方法建立了8種ACs 定性定量檢測的方法， 但由于食品中氨基酸種類較多，每種氨基酸在適當(dāng)?shù)臈l件下都有可能形成ACs，因此這個(gè)檢測方法并不能真實(shí)地反應(yīng)食品中ACs 的含量，而且有機(jī)相中的優(yōu)化條件并不適用于食品體系，不能指導(dǎo)工業(yè)化生產(chǎn)。 所以探究如何在水相中合成更多種的ACs，并建立多種ACs 定性定量檢測的方法尤為重要。

作者在水相體系中合成4種ACs 的方法，建立12種ACs 的UPLC-MS/MS 同步檢測的方法， 并對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，使其能更加真實(shí)地代表食品體系中美拉德反應(yīng)產(chǎn)生ACs 的總量，檢測了市售產(chǎn)品中ACs 的含量，驗(yàn)證了該方法的適用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、甘氨酸、D-葡萄糖、 氫氧化鈉、 濃鹽酸、 氨水、 甲酸、 甲酸銨、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；C18固相萃取小柱： 美國Sepax 科技有限公司產(chǎn)品；Dowex 50WX4 氫型（200～400 目）離子交換樹脂：百靈威科技有限公司產(chǎn)品；色譜級(jí)甲醇和乙腈：美國Tedia 公司產(chǎn)品；超純水，實(shí)驗(yàn)室自制。

表1 不同產(chǎn)地與品種的果蔬干樣品Table 1 Dried fruits and vegetables samples from different origins and varieties

1.2 儀器與設(shè)備

1525 高效液相色譜儀（蒸發(fā)光檢測器）、MALDI SYNAPT MS 超高效液相串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀、UPLC-TQD 超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜 聯(lián) 用 儀： 美 國 Waters 公 司 產(chǎn) 品；Aduance Ⅲ400 MHz 全數(shù)字化核磁共振波譜儀： 德國布魯克AXS 有限公司產(chǎn)品；RV06-ML型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA 公司產(chǎn)品； 超純水儀： 美國密理博公司產(chǎn)品；HJ-6 多頭磁力攪拌器： 金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；電子天平：上海梅特勒-托利多儀器商貿(mào)公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ACs 的合成作者前期合成的8種ACs 參照 以 下 方 法 進(jìn) 行[9]。 Fru-Val（Fru-Leu、Fru-His、Fru-Ala、Fru-Met、Fru-Phe）化合物按照以下方法進(jìn)行合成。 300 mmol/L 的D-葡萄糖溶解在400 mL 的甲醇-N，N-二甲基甲酰胺溶液中（體積比1∶1），加入400 mmol/L 的氨基酸， 然后制備好的溶液在80 ℃下回流3 h。加入90 mmol/L 丙二酸，在80 ℃下繼續(xù)回流2 h 直至淺棕色， 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機(jī)相濃縮至50 mL 左右。

Fru-Arg 化合物按照以下方法進(jìn)行合成。 L-精氨酸溶于由30 mL 吡啶和30 mL 冰醋酸組成的混合溶劑中，室溫下攪拌1.0～1.5 h，將氯化鋅加入混合物中，隨后D-葡萄糖緩慢加入溶液中，在30 ℃下攪拌5 d。

Fru-Glu 化合物按照以下方法進(jìn)行合成。 準(zhǔn)確稱取氫氧化鉀完全溶解在240 mL 無水甲醇中，將研磨后的谷氨酸鈉添加到溶解有氫氧化鉀的無水甲醇中，將液體轉(zhuǎn)移到盛有D-葡萄糖的250 mL 燒瓶中，75 ℃回流35 min，用冰水冷卻至室溫，將有機(jī)相旋蒸濃縮至50 mL， 然后在-20 ℃冷凍3～4 h，過濾取上清液加入預(yù)冷的-18 ℃丙酮沉淀， 真空抽濾并用丙酮兩次洗滌濾餅。 將所得的固體溶于30 mL無水甲醇中，加入1 mL 乙酸，在75 ℃條件下回流20 min。

將上述反應(yīng)混合物冰水浴冷卻至室溫，過濾取上清液加入預(yù)冷的-18 ℃丙酮沉淀，在10000 r/min，4 ℃條件下離心10 min，收集沉淀物，用無水甲醇復(fù)溶，再用丙酮沉淀，反復(fù)重結(jié)晶幾次，用一定量的超純水溶解晶體并冷凍干燥，得到白色固體。

Fru-Pro（Fru-Ser、Fru-Thr、Fru-Gly）化合物按照以下方法進(jìn)行合成。 分別稱取L-脯氨酸5.7565 g（0.05 mol）與D-葡萄糖和9.008 g（0.05 mol）溶于50 mL 去離子水中，置于磁力攪拌器中攪拌，使其完全溶解。 將溶液pH 調(diào)至7.4。 然后將溶液轉(zhuǎn)移至120 mL 耐壓瓶中， 于100 ℃油浴鍋中反應(yīng)60 min。反應(yīng)結(jié)束后，立即放入冰水中冷卻。 在50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)掉反應(yīng)溶液中的水。 其余3種氨基酸根據(jù)溶解度差異， 分別配置成不同質(zhì)量濃度的溶液，L-絲氨酸反應(yīng)溶液、L-蘇氨酸反應(yīng)溶液、 甘氨酸反應(yīng)溶液分別配置成0.2853、0.1496、0.2552 mg/mL。

1.3.2 ACs 的純化加入少量水溶解旋蒸后固體，用適量活性炭除去反應(yīng)溶液中的色素等雜質(zhì)后，將其轉(zhuǎn)移至填充有Dowex 50WX4 樹脂的柱中， 用去離子水沖洗掉葡萄糖等雜質(zhì)，直至TTC 測試顯示陰性為止。 然后用0.2 mol/L 的氨水溶液洗脫樹脂，收集TTC 測試呈陽性的洗脫液，每10 mL 洗脫液收集在一個(gè)離心管中。隨后用HPLC-ELSD 檢測，收集只含有ACs 的洗脫液。 所有洗脫液合并后進(jìn)行冷凍干燥得到ACs 固體粉末。

其中，HPLC-ELSD 所使用的色譜柱為XBridge BEH Amide（5 μm，4.6 mm×250 mm）。 柱溫：35 ℃，氣體流量：1.5 L/min；流量：1 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL。該方法流動(dòng)相分別為乙腈（A 相）和10 mmol/L 甲酸銨水溶液（B 相），采用梯度洗脫的方法進(jìn)行測定，流動(dòng)相A 梯度變化如下：0 min 到5 min，A 相由體積分?jǐn)?shù)80% 變?yōu)?0% A；5 min 到10 min，A 相由體積分?jǐn)?shù)70%變?yōu)?5%；10 min 到11 min，A 相由體積分?jǐn)?shù)65%變?yōu)?0%；11 min 到15 min，A 相由體積分?jǐn)?shù)65%變?yōu)?0%，總時(shí)間為15 min。

1.3.3 ACs 的UPLC-MS/MS 分析采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀 （UPLCMS/MS）進(jìn)行分析鑒定。

其中色譜條件如下，色譜柱：CORTECS C18（1.6 μm，2.1 mm×150 mm）；柱溫：35 ℃，流量：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；流動(dòng)相A 相為乙腈，B 相為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸。 采用梯度洗脫的方法，流動(dòng)相A 梯度變化如下：0 min 到2 min，A 相為體積分?jǐn)?shù)0%，2 min到5 min，A 相由體積分?jǐn)?shù)0%變?yōu)?0%，5 min 到7 min，A 相由體積分?jǐn)?shù)10%變?yōu)?0%，7 min 到8 min，A 相由體積分?jǐn)?shù)40%變?yōu)?0%，8 min 到8.10 min，A 相由體積分?jǐn)?shù)80%變?yōu)?%，8.10 min 以后，A 相維持體積分?jǐn)?shù)0%，總共運(yùn)行10 min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子電離模式（ESI+），離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：400 ℃；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔電壓：20 V；錐孔氣流量：50 L/h；碰撞能量：6.0 eV；m/z：100～1000；檢測電壓：1600 V；高純氮?dú)猓?9.999%）。 使用Mass Lynx 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.3.4 ACs 的NMR 分析稱取10 mg 產(chǎn)物溶于氘水中。 25 ℃（298K）條件下，在配備有5 mm PABBO探針的Bruker DRX 400 MHz 波譜儀上進(jìn)行操作，得 到1H -NMR 譜 和13C -NMR 譜 后， 利 用MestReNova 軟件處理數(shù)據(jù)。

1.3.5 單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配置分別準(zhǔn)確稱量適量Fru-Arg，F(xiàn)ru-Phe，F(xiàn)ru-His，F(xiàn)ru-Met，F(xiàn)ru-Glu，F(xiàn)ru-Leu，F(xiàn)ru-Val，F(xiàn)ru-Ala，F(xiàn)ru-Pro，F(xiàn)ru-Ser，F(xiàn)ru-Thr，F(xiàn)ru-Gly 12種ACs 的標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中，加入少量超純水溶解， 待完全溶解后， 分別定容至10 mL容量瓶，所有儲(chǔ)備液于4 ℃冰箱中保存。

1.3.6 建立UPLC-MS/MS 定性定量測定ACs 的方法利用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)ACs 進(jìn)行定性定量分析。

液相條件：色譜柱：CORTECS C18（1.6 μm，2.1 mm×150 mm）；流動(dòng)相：A 相：乙腈，B 相：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸；柱溫：35 ℃，流量：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL，梯度洗脫程序：0 min B 相體積分?jǐn)?shù)100%，1 min 到5 min，B 相由體積分?jǐn)?shù)100%變?yōu)?0%，5 min 到6 min，B 相由體積分?jǐn)?shù)90%變?yōu)?0%，6 min 到7 min，B 相由體積分?jǐn)?shù)50%變?yōu)?0%，7 min 到9 min，B 相保持體積分?jǐn)?shù)20%，9.0 min 到9.5 min，B 相由體積分?jǐn)?shù)20%變?yōu)?00%，9.5 min 到13.0 min，B 相保持體積分?jǐn)?shù)100%， 總運(yùn)行時(shí)間為13 min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子電離模式（ESI+），離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：400 ℃；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔氣流量：50 L/h；m/z：100～1000；檢測電壓：1600 V；高純氮?dú)猓?9.999%）。

1.3.7 方法學(xué)驗(yàn)證方法學(xué)驗(yàn)證主要從線性范圍、檢測限（LOD）、定量限（LOQ）、回收率、精密度等方面出發(fā)。 取各ACs 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液用超純水稀釋成一系列濃度梯度。 按上述液質(zhì)方法測定。 測定結(jié)果以標(biāo)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并做線性回歸分析。 LOD 和LOQ 方面主要稀釋ACs 標(biāo)品，用液質(zhì)檢測其相應(yīng)信號(hào)，以目標(biāo)峰的信噪比為10 時(shí)所對(duì)應(yīng)的ACs 質(zhì)量濃度為LOQ，以目標(biāo)峰的信噪比為3 時(shí)所對(duì)應(yīng)的ACs 質(zhì)量濃度為LOD。 選取已知的ACs 含量的模擬體系溶液，分別添加/不添加ACs 標(biāo)品，比較加標(biāo)組和不加標(biāo)組ACs 的差異，并計(jì)算相應(yīng)的回收率。 精密度試驗(yàn)主要是同一個(gè)模擬體系樣品溶液在24 h 內(nèi)間隔測定5次，比較所測樣品質(zhì)量濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3.8 市售果蔬干產(chǎn)品中ACs 的檢測首先采用GB 5009.3-2016 對(duì)市售13種果蔬干產(chǎn)品進(jìn)行水分含量的測定，計(jì)算產(chǎn)品的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

分別稱取13種果蔬干產(chǎn)品各5 g， 加入50 mL超純水打漿，倒入離心管中，超聲波提取20 min，10000 r/min 條件下冷凍離心10 min， 取上清液定容至100 mL，待凈化使用。選取固相萃取小柱，先用3 mL 甲醇活化小柱， 再用3 mL 超純水平衡小柱，取2 mL 上清液至C18 小柱中， 用3 mL 超純水洗脫，收集洗脫液并定容至10 mL，隨即用1.3.6 方法UPLC-MS/MS 測定產(chǎn)品中的ACs 含量。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0 軟件處理，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，p＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACs 的合成與純化

在水相中合成4種ACs，無污染，并且適用于大規(guī)模生產(chǎn)。 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的純化分離主要采用Dowex 50WX4 氫型離子交換樹脂，葡萄糖不與樹脂結(jié)合，直接被去離子水沖洗掉，氨基酸和ACs 與樹脂結(jié)合后，被氨水先后洗脫下來；隨后用TTC 進(jìn)行檢測，當(dāng)洗脫液中含有ACs 時(shí)，使無色的氧化型的TTC 還原成紅色的還原型的TTC，使樣品染成紅色；由于ACs 對(duì)紫外沒有吸收，因此選用對(duì)絕大部分物質(zhì)都有響應(yīng)的蒸發(fā)光檢測器對(duì)洗脫液進(jìn)行檢測，進(jìn)一步分離氨基酸與ACs，選擇只含ACs 的洗脫液并將其合并凍干，得到白色或者淡黃色粉末，由于ACs極其容易吸潮，所以應(yīng)隔絕空氣保存。

2.2 UPLC-MS/MS 分析ACs

制備后得到的ACs 純品配成約1 mg/mL 的標(biāo)品溶液，使用UPLC-MS/MS 進(jìn)行分析。 結(jié)果表明，4種ACs 的純度均高于98%。 以Fru-Pro 為例，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)及質(zhì)譜結(jié)果分析，其在液質(zhì)中可能的碎裂規(guī)律如圖1 所示。該標(biāo)品的總離子流色譜圖（圖2（a））中僅存在一個(gè)單峰，其保留時(shí)間為1.14 min，另外圖2（b）為Fru-Pro 的質(zhì)譜圖。 標(biāo)品在質(zhì)譜中的碎裂規(guī)律基本與苑蘅等人[10]的研究一致。 從質(zhì)譜圖中可以看出，4種ACs 的質(zhì)荷比（m/z）分別為Fru-Pro：278；Fru-Ser：268；Fru-Thr：282；Fru-Gly：238。 其中4種化合物的碎片離子[M+H-H2O]+、[M+H-2H2O]+、[M+H-3H2O]+也分別在各自的質(zhì)譜圖中觀察到，以[M+H-H2O]+碎片離子信號(hào)最強(qiáng)，這與Cui 等人[11]的研究一致。 從Fru-Pro 質(zhì)譜圖中可以看出，[M+HH2O]+和[M+H-2H2O]+碎片離子的信號(hào)峰最強(qiáng)，這也表明了ACs 在質(zhì)譜中極容易脫掉水。 液質(zhì)結(jié)果表明4種ACs 的分子式和相對(duì)分子質(zhì)量分別為Fru-Pro（C11H19NO7，277），F(xiàn)ru-Ser （C9H17NO8，267），F(xiàn)ru-Thr（C10H19NO8，281），F(xiàn)ru-Gly（C8H15NO7，237）。

圖1 UPLC-MS/MS 譜中Fru-Pro 片段Fig. 1 Fru-Pro fragment in UPLC-MS/MS spectrum

2.3 NMR 分析ACs

Fru-Pro 的1H-NMR 和13C-NMR 見圖3。 由于ACs 在水中可進(jìn)行互變異構(gòu)， 糖骨架可形成α-呋喃結(jié)構(gòu)、β-呋喃結(jié)構(gòu)、α-吡喃結(jié)構(gòu)和β-吡喃結(jié)構(gòu)，共有5種同分異構(gòu)體，根據(jù)環(huán)張力和取代基位阻的分析，4種異構(gòu)體的穩(wěn)定性順序?yàn)椋害?吡喃環(huán)>α-呋喃環(huán)>β-呋喃環(huán)>α-吡喃環(huán)。5種同分異構(gòu)體如圖4 所示。

圖2 Fru-Pro 的總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖Fig. 2 Total ion chromatogram and mass spectrometry of Fru-Pro

圖3 Fru-Pro 的1H-NMR 與13C-NMRFig. 3 1H-NMR and 13C-NMR of Fru-Pro

圖4 Fru-Pro 的5種同分異構(gòu)體Fig. 4 Five isomers of Fru-Pro

13C-NMR 上可把峰分為11 組， 每組峰基本由不同強(qiáng)度的4個(gè)峰組成，強(qiáng)度比約為10∶3∶2∶1，按每組4個(gè)峰分別對(duì)應(yīng)4種異構(gòu)體，則相同碳位的信號(hào)峰比較相近。 糖環(huán)上的碳因五元環(huán)和六元環(huán)的環(huán)張力有較大差異，所以3-5 位的碳的信號(hào)峰位移差別明顯，根據(jù)以上分析，將每組峰根據(jù)化學(xué)位移歸屬至各個(gè)碳位，再根據(jù)各組內(nèi)峰的強(qiáng)弱歸屬至不同的異構(gòu)體，分析得出化學(xué)位移歸屬，結(jié)果見表2。

表2 Fru-Pro 的化學(xué)位移分析Table 2 Chemical shift analysis of Fru-Pro

2.4 UPLC-MS/MS 測定方法的建立

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS/MS）以其高分辨率和高靈敏度被廣泛用于多種有機(jī)化合物的同步快速分析。 作者建立了一種UPLC-MS/MS 的方法用于同步分析12種ACs 化合物。 12種ACs 的色譜分離使用CORTECS C18柱，流動(dòng)相分別為乙腈（A）和甲酸（B）。 比較了不同的流動(dòng)相梯度對(duì)12種ACs 的分離效果和保留時(shí)間的影響，并確立了最終的液相條件。 質(zhì)譜方面，根據(jù)12種ACs 在質(zhì)譜中的碎裂規(guī)律確立了其相應(yīng)的母離子和子離子，采用MRM 進(jìn)行同步分析。根據(jù)先前的研究，正離子模式下的質(zhì)譜掃描的結(jié)果要優(yōu)于負(fù)離子模式，因?yàn)榘被汪然仍谡x子模式下更容易穩(wěn)定。 作者也發(fā)現(xiàn)12種ACs 在正離子模式下有著更好地響應(yīng)。 選擇信號(hào)最強(qiáng)的碎片離子作為子離子，根據(jù)12種化合物的質(zhì)譜結(jié)果，確立了其最佳的母 離 子 和 子 離 子 為Fru-Arg：337→114，F(xiàn)ru-Glu：310→148，F(xiàn)ru-His：318 →190，F(xiàn)ru-Met：312→294，F(xiàn)ru-Leu：294 →230，F(xiàn)ru-Val：280 →216，F(xiàn)ru-Ala：252 →234，F(xiàn)ru-Phe：328→292，F(xiàn)ru-Pro：278 →260；Fru-Ser：268 →250；Fru-Thr：282 →264；Fru-Gly：238 →220。 隨后，對(duì)12種ACs 的錐孔電壓和碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表3 所示。 在12種ACs 的質(zhì)譜圖中，[M+H-H2O]+和氨基酸的氫離子加合物都是其特征子離子，這和文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。 另外，[M+H-2H2O]+的碎片離子也表現(xiàn)較強(qiáng)的信號(hào)。 隨后， 對(duì)該UPLC-MS/MS 方法進(jìn)一步進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

表3 用于多反應(yīng)監(jiān)測的ACs 的MS 參數(shù)Table 3 MS parameters of ACs for multiple reaction monitoring

如表4 所示，4種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性系數(shù)（R2）均大于0.99。 儀器檢測靈敏度主要通過其對(duì)標(biāo)品的檢測限（LOQ）和定量限（LOQ）來評(píng)估，結(jié)果見表4。本方法有著較好的回收率，這可能是因?yàn)槟M體系中樣品基質(zhì)比實(shí)際食品體系簡單，因此目標(biāo)物更容易保留。 精密度實(shí)驗(yàn)通過樣品的5次不同時(shí)間段測定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來評(píng)估。 這些數(shù)據(jù)均表明作者所建立的方法具有良好的重現(xiàn)性，并適合實(shí)際體系的ACs 的分析。

表4 ACs 的UPLC-MS / MS 方法的分析特征Table 4 Analytical characteristics of ACs by UPLC-MS / MS method

2.5 市售果蔬干產(chǎn)品中ACs 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測

表5 果蔬干產(chǎn)品中ACs 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 5 ACs content in commercially available dried fruits and vegetables mg/g

由表5 可以看出，13種果蔬干產(chǎn)品中含有大量的ACs 化合物，這可能是因?yàn)楣弋a(chǎn)品在加工過程中經(jīng)過熱處理而產(chǎn)生的，其中，枸杞、馬奶子和桂圓中ACs 質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多，分別達(dá)到了10.73，6.80，5.36 mg/g，而ACs 質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低的有奇異果，圣女果，芒果干和西梅干等。 而每種果蔬干產(chǎn)品中所含ACs 的種類和含量各不相同，這可能是由于每種果蔬中本身所含有的氨基酸與還原糖種類不同，并且每種果蔬干產(chǎn)品的加工方式不同所導(dǎo)致。 桂圓中含量較高的氨基酸有谷氨酸和丙氨酸，馬奶子中含量最高的氨基酸為谷氨酸，葡萄干中氨基酸含量最高的為精氨酸，在產(chǎn)品中這些氨基酸相對(duì)應(yīng)的ACs 產(chǎn)物也是最多的。從表5 可以看出，ACs 質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的果蔬干產(chǎn)品中，他們的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)也較低，這有可能說明低水分活度更容易使產(chǎn)生大量的ACs。

續(xù)表5mg/g

3 結(jié) 語

通過在水相中加熱葡萄糖與氨基酸的美拉德反應(yīng)，制備了Fru-Pro，F(xiàn)ru-Ser，F(xiàn)ru-Thr，F(xiàn)ru-Gly。通過大孔樹脂、HPLC-ELSD、UPLC-MS/MS 和NMR 鑒定并表征了4種ACs，純度均在98%以上，其分子式及相對(duì)分子質(zhì)量分別為Fru-Pro（C11H19NO7，MW：277），F(xiàn)ru-Ser（C9H17NO8，MW：267），F(xiàn)ru-Thr（C10H19NO8，MW：281），F(xiàn)ru-Gly（C8H15NO7，MW：237）。建立了液質(zhì)同步檢測12種ACs 的方法， 該方法目標(biāo)物分離度高，分離時(shí)間短，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法線性關(guān)系好，靈敏度高，更能真實(shí)地反應(yīng)食品體系中ACs 的含量。