基于重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的犬冠狀病毒快速檢測方法的建立

陳 堅(jiān)，張丹琳，馬 磊，伍妙梨

(1.廣西柳州畜牧獸醫(yī)學(xué)校，廣西 柳州 545003 ； 2.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測所，廣東 廣州 510633)

犬冠狀病毒病、犬瘟熱與犬細(xì)小病毒病是犬的三大烈性傳染病，其中，犬瘟熱與犬細(xì)小病毒病流行較廣、危害較大，已引起廣大寵物飼養(yǎng)者與銷售者的高度重視，但目前對(duì)犬冠狀病毒了解不多，重視不夠，近年來該病發(fā)病率逐年增加，對(duì)養(yǎng)犬業(yè)造成的危害越來越嚴(yán)重[1-3]。

犬冠狀病毒病是一種以犬胃腸炎為主的高度接觸性傳染病。該病發(fā)病急、傳染快、病程短，對(duì)幼犬的危害尤其嚴(yán)重，是引起幼犬急性胃腸炎的重要病毒之一[4]。該病由犬腸道冠狀病毒(Canine coronavirus,CCoV)引起，為單股正鏈RNA病毒，屬于尼多病毒目、冠狀病毒科、α冠狀病毒屬[5]。病毒粒子多呈圓形或橢圓形，囊膜表面帶有冠狀病毒典型的樹突狀的“冠”，并呈放射狀整齊地排布于整個(gè)病毒粒子表面。CCoV主要有4種結(jié)構(gòu)蛋白，分別是跨膜蛋白M，纖突蛋白S，核衣殼蛋白N和膜蛋白E，其中S蛋白與病毒的致病性、免疫原性和細(xì)胞毒性密切相關(guān)，可與細(xì)胞受體相作用，引起細(xì)胞融合，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要成分[6]。

鑒于CCoV常與犬瘟熱、犬細(xì)小病毒、腸道寄生蟲等混合感染，由于缺乏完善的CCoV檢測手段，經(jīng)常容易出現(xiàn)誤診，故需要臨床癥狀結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷尚能對(duì)其進(jìn)行確診。目前，國內(nèi)診斷犬冠狀病毒可采用病毒分離鑒定和血清學(xué)診斷等方法[7]。PCR是近年來快速發(fā)展的一種可用于病原體檢測的技術(shù)，具有快速、敏感、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病的檢測、臨床診斷等。目前，應(yīng)用于CCoV檢測的技術(shù)包括RT-PCR和熒光定量RT-PCR，這些檢測方法通常需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的操作人員，在現(xiàn)場檢測中不具備優(yōu)勢，因此，需要更簡便的技術(shù)來提高檢測效率[8]。等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)為快速檢測技術(shù)帶來新的曙光[9-10]。重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(Recombinase polymerase amplification,RPA) 利用特殊的酶在25～43 ℃條件下即可打開模板鏈，并進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)時(shí)間更短且不需要熱變性[11]。與傳統(tǒng)PCR相比既降低了檢測成本，且不受限于檢測場地[12]。本試驗(yàn)建立了一種用于CCoV的快速檢測重組酶聚合酶擴(kuò)增檢測方法(Reverse-transcription recombinase polymerase amplification, RT-RPA)，并用于臨床樣品的檢測。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RPA試劑，購自杭州眾測生物科技有限公司。PrimerscriptTMone step RT-PCR kit、DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均購自寶生物工程(大連)有限公司?；蚪MDNA/RNA共抽提試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司。pGEM-T easy 載體、RiboMAX Large Scale RNA Production System T7試劑盒，均購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司。犬冠狀病毒熒光定量PCR檢測試劑盒，購自北京天恩澤基因科技有限公司。

1.2 病毒株和臨床樣品 犬冠狀病毒、犬瘟熱病毒(CDV)、犬細(xì)小病毒(CPV)由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒(CAV)核酸由本實(shí)驗(yàn)室保存提供。25份臨床樣品為犬糞便，由本地的寵物醫(yī)院提供，并于-20 ℃保存。

1.3 引物的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)NCBI上CCoVM基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 所用的引物序列信息

1.4 RNA的提取及RNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備 按照基因組DNA/RNA共抽提試劑盒使用說明書分別提取CCoV、CDV、CPV等病毒及臨床樣品的核酸，并于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用?中的CCoV-F3和CCoV-F4引物，以CCoV病毒基因組RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲取大小為680 bp的目的片段。使用DNA純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后連接到pGEM-T easy載體上，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取轉(zhuǎn)化的單克隆抽提質(zhì)粒并進(jìn)行測序鑒定，獲得重組質(zhì)粒pGEM-T-CCoV。使用限制性內(nèi)切酶NdeI對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行線性化處理，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，隨后用RiboMAX Large Scale RNA Production System T7試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，以獲得體外轉(zhuǎn)錄的CCoV RNA。

1.5 RT-RPA反應(yīng) 參照試劑盒說明書配制RT-RPA反應(yīng)體系，其中A Buffer 41.5 μL、B Buffer 2.5 μL、CCoV F1/F2各2 μL、病毒RNA 2 μL。反應(yīng)條件為35 ℃恒溫孵育15 min。隨后使用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)RPA產(chǎn)物進(jìn)行純化，并取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并分析電泳結(jié)果。

1.6 特異性和敏感性分析 以犬其他常見病毒CDV、CPV、CAV、CPIV等核酸為模板進(jìn)行RT-RPA反應(yīng)，評(píng)估所建立的CCoV RT-RPA檢測方法的特異性。對(duì)體外轉(zhuǎn)錄的CCoV 標(biāo)準(zhǔn)RNA進(jìn)行10倍系列稀釋，選取濃度為1×108拷貝/μL～1×100拷貝/μL作為RT-RPA敏感性分析的模板，以確定所建立的方法的檢出限，每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù)，并進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.7 臨床樣品檢測 以所建立的RT-RPA方法對(duì)25份臨床樣品進(jìn)行檢測，并同時(shí)與Real-time RT-PCR方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 RT-RPA反應(yīng)條件的優(yōu)化 利用方陣試驗(yàn)進(jìn)行RT-RPA的反應(yīng)溫度(30、32、35、37、40 ℃和42 ℃)和孵育時(shí)間(10、15、20 min和25 min)的優(yōu)化。結(jié)果表明，35 ℃反應(yīng)15 min時(shí)所擴(kuò)增的目的條帶最亮，故本試驗(yàn)中RT-RPA的最佳反應(yīng)條件為35 ℃,15 min。

2.2 特異性和敏感性分析 以其他病毒DNA/RNA為模板進(jìn)行CCoV RT-RPA特異性試驗(yàn)，結(jié)果表明，所建立的RT-RPA方法具有良好的特異性，僅針對(duì)CCoV有特異性擴(kuò)增條帶，而對(duì)CDV、CPV、CAV、CPIV等其他常見病原無任何特異性擴(kuò)增(圖1)。

以1×108～1×100拷貝/μL體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示,所建立的RT-RPA方法的最低檢出限為1×102拷貝/μL(見圖2)，3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖1 CCoV RT-RPA檢測方法的特異性分析Fig.1 Specificity analysis of RT-RPA for CCoV detectionM：DL-2 000 DNA Marker； 1：CDV； 2：CPV；3：CCoV； 4：CAV； 5：CPIV； 6：陰性對(duì)照M：DL-2 000 DNA Marker； 1：CDV； 2：CPV；3：CCoV； 4：CAV； 5：CPIV； 6：Negative control

圖2 CCoV RT-RPA敏感性分析結(jié)果Fig.2 Sensitivity analysis of RT-RPA for CCoV detectionM：DL-2 000 DNA Marker； 8～0：1×108～1×100拷貝/μL的體外轉(zhuǎn)錄RNA； NC：陰性對(duì)照M：DL-2 000 DNA Marker； 8～0:In vitro transcriptional RNA of 1×108～1×100 copies/μL; NC：Negative control

2.3 臨床樣品的檢測 使用所建立的RT-RPA方法及熒光定量RT-PCR方法對(duì)25份臨床樣品進(jìn)行CCoV檢測，并對(duì)其檢測結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果(見表1)顯示2種檢測方法的符合率一致，陽性檢出率均為48%(12/25)。

3 討論

CCoV是一種犬的腸道病原體，患病幼犬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、脫水甚至死亡，為了有效預(yù)防和控制CCoV的感染及傳播,建立一種快速、敏感的檢測方法至關(guān)重要[13]。本試驗(yàn)所建立的RT-RPA檢測技術(shù)具有特異性好、敏感性高等特點(diǎn)，為CCoV的檢測提供了一種簡單、便捷、準(zhǔn)確、可靠的方法。RPA技術(shù)與普通PCR技術(shù)相比，最大的優(yōu)點(diǎn)是不需要在較高的溫度循環(huán)下對(duì)模板進(jìn)行變性和擴(kuò)增，利用特殊的酶在25～43 ℃條件下打開模板并完成對(duì)核酸的擴(kuò)增。因?yàn)椴恍枰獰嶙冃?，反?yīng)時(shí)間更短，而且不依賴昂貴的設(shè)備即可完成[14-15]。本試驗(yàn)通過序列分析，針對(duì)CCoVM基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)并合成引物，建立了RT-RPA檢測方法并實(shí)現(xiàn)對(duì)25份臨床樣品的精準(zhǔn)檢測。目前所建立的CCoV RT-RPA方法為基礎(chǔ)型RPA技術(shù)，為了排除反應(yīng)體系中的組分對(duì)電泳結(jié)果的干擾，一般需對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收后方可進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，不利于臨場檢測。通過在RPA擴(kuò)增基礎(chǔ)體系中加入不同的酶及熒光探針，可實(shí)現(xiàn)多樣化的RPA檢測，如熒光定量RPA、側(cè)流層析RPA (LF-RPA)等[16-17]。

表2 RT-RPA和普通PCR檢測CCoVTable 2 The comparison of RT-RPA and conventional PCR for CCoV detection

綜上所述，本試驗(yàn)建立了CCoV 的RT-RPA快速檢測方法，35 ℃恒溫條件15 min即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的片段的有效擴(kuò)增，具有操作簡單、特異性好、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于犬CCoV的快速檢測。