肩袖肌腱損傷誘導(dǎo)性動物模型構(gòu)建評價及研究進展

許博洋,龐小娟,曾禹銘,周嚴冬,郭義

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,天津 301617; 2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,天津 301617;3. 天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,天津 301617; 4. 天津中醫(yī)藥大學(xué)實驗針灸學(xué)研究中心,天津 301617;5. 國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津 300381)

肩關(guān)節(jié)是人體中最易移動且受約束最少的關(guān)節(jié),其功能穩(wěn)定性和固有關(guān)節(jié)活動度之間的平衡依賴于整個肩部靜態(tài)和動態(tài)穩(wěn)定系統(tǒng)的共同復(fù)合作用[1]。 RC 是由肩胛下肌(Subscapularis,SSc)、岡上肌(Supraspinatus,SS)、岡下肌(Infraspinatus,IS)和小圓肌(Teres minor,TM)所組成的肌群,在肩關(guān)節(jié)的動態(tài)穩(wěn)定機制中扮演著重要角色。 RC 通過肌肉的收縮活動平衡機械載荷所引起的去穩(wěn)定化和穩(wěn)定化作用,其中SS 和SSc 通過施加于冠狀面和水平面上的應(yīng)力應(yīng)變作用來幫助肩部運動,同時將肱骨頭居中壓在肩胛盂上,從而保證在整個運動弧線上的關(guān)節(jié)穩(wěn)定[2-3]。 因此,當(dāng)發(fā)生肩袖肌腱損傷后,肩關(guān)節(jié)失去肩袖的主被動約束作用,穩(wěn)定性急劇下降。 傳統(tǒng)意義上認為,退行性RC 撕裂好發(fā)于SS 肌腱的前部,與肱二頭肌肌腱相鄰。 現(xiàn)認為其主要發(fā)生于肱二頭肌后方約15 mm 處的SS 和IS 的交界處[4]。 急性創(chuàng)傷引起的RC 損傷,通常以SS 肌腱的受累較為常見,損傷部位多位于距肱骨大結(jié)節(jié)止點約1 cm 處。 目前在臨床上,RC 修復(fù)技術(shù)通常是使用縫合錨釘將斷裂的肌腱錨定在其解剖足跡上,修復(fù)的肌腱-骨連接逐漸被纖維瘢痕界面取代,而不是通過纖維軟骨區(qū)域天然附著部位而重建[5]。 因此,由于RC 肌腱與骨骼之間的愈合能力不好,術(shù)后再撕裂率和并發(fā)癥發(fā)生率仍處于較高水平,積極開發(fā)有利于肌腱解剖學(xué)上的軟-硬組織過渡的生物材料或外科技術(shù),對RC 損傷的修復(fù)效果有一定的積極意義。 成熟的動物模型能為我們理解RC 肌腱損傷的發(fā)病機制有著很大的推進作用。 本文將以肌腱-骨骼的生物力學(xué)特性為出發(fā)點,介紹國內(nèi)外各種急慢性RC 損傷動物模型的制備方法及功能評估,為后期RC 損傷的基礎(chǔ)科研提供一定參考。

1 肩袖肌腱的生物力學(xué)環(huán)境

RC 又稱腱袖、旋轉(zhuǎn)袖,組成RC 的四塊肌肉分別從肩胛骨向前延伸包繞肱骨頭,維持肩關(guān)節(jié)穩(wěn)定。 SS 起源于肩胛骨的岡上窩,其肌腱穿過肩胛下間隙,附著于大結(jié)節(jié)的上、中面;IS 和TM 起源于岡下窩和肩胛骨外側(cè)緣背面,其肌腱分別附著于大結(jié)節(jié)的中部和下側(cè);SSc 起源于肩胛下窩,其肌腱附著于肱骨小結(jié)節(jié)。 四塊肌肉的肌腱在其附著點附近融合成一個連續(xù)的結(jié)構(gòu)。 肌腱與骨的結(jié)合部位便是腱-骨止點,主要包括肌腱致密纖維結(jié)締組織層、纖維軟骨層、鈣化軟骨層和骨組織層,這四個依次連續(xù)漸變的組織結(jié)構(gòu)[6]。 肌腱組織層主要由I 型、XII 型膠原纖維以及蛋白聚糖組成,含有紡錘狀成纖維細胞[7]。 隨著肌腱軟組織向骨組織的過渡,細胞類型由成纖維細胞向骨細胞或成骨細胞轉(zhuǎn)變,纖維蛋白的種類和走向也由整齊排列的XII 膠原纖維向隨機分布高度礦化的I 型纖維變化[8-9]。 其納米微觀角度的關(guān)鍵機制在于：軸向載荷介導(dǎo)下,盤曲的三螺旋小分子結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生軸向拉伸,最終導(dǎo)致纖維結(jié)構(gòu)的解螺旋過程,從而引起膠原纖維分層排列的疏密轉(zhuǎn)變[10]。 膠原纖維的變化是維持RC 肌腱良好粘彈性和異質(zhì)性的主要原因,循環(huán)加載誘導(dǎo)膠原纖維偏向力的方向,并在應(yīng)變時產(chǎn)生非線性剛度,增加肌腱強度[11-12]。 當(dāng)異常載荷變化作用于RC,肌腱細胞通過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶加速膠原纖維代響應(yīng)刺激,促進炎性細胞因子的分泌和細胞凋亡基因表達,將造成腱細胞大量凋亡、腎上腺素能受體增加(但并不會發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng))。 在長期損傷的持續(xù)累積下組織機械性能會大幅度降低,顯著的局部肌腱應(yīng)變集中,將易于發(fā)生肌腱的表面部分性斷裂,最終演變?yōu)镽C 的全層撕裂[13-14]。

2 肩袖損傷動物模型的建立

動物模型是了解RC 肌腱損傷的組織生物學(xué)及病理學(xué)基礎(chǔ)、開發(fā)新技術(shù)以改善現(xiàn)有治療方法的實用手段。 從目前的研究報道來看,針對不同階段的病理進程,現(xiàn)已建立出較多的RC 肌腱損傷模型。

2.1 急性肩袖肌腱撕裂模型

目前,國內(nèi)外主要是通過手術(shù)創(chuàng)傷的方式誘導(dǎo)急性RC 肌腱損傷動物模型建立,通常以SS 為施術(shù)部位,建立 SS 肌腱損傷模型(Carpenter 模型)。 主要操作是通過肩胛岡遠端前內(nèi)側(cè)或肩肱關(guān)節(jié)頭側(cè)作1.0 cm 小切口,沿肩胛岡下緣鈍性分離皮下組織和三角肌,向肩峰方向?qū)ふ也⒈┞禨S 肌腱,于肱骨大結(jié)節(jié)止點處鈍性離斷,然后以6-0 可吸收縫線將其原位縫合。 術(shù)前術(shù)后可通過注射青霉素、慶大霉素以及頭孢曲松鈉預(yù)防感染并于術(shù)后蘇醒允許自由行走,1 ～2 周成模。 進一步的研究證實,為了防止實驗動物自發(fā)肌腱愈合或瘢痕形成,通常需要修整肱骨大結(jié)節(jié)附著點與岡上肌腱,剔除多余軟組織,刮凈離斷處肱骨端殘留纖維軟骨層直至骨質(zhì)。如若對SS 肌腱2 ～3 mm(＜50%止點處肌腱寬度)或0.5 cm × 0.5 cm 的組織施以切除[15-16],則將建立全層RC 損傷模型。 此外,也有通過離斷SSc 肌腱建立RC 損傷動物模型的報道,但研究數(shù)量不多。然而,為了使肩關(guān)節(jié)獲得較高的機械穩(wěn)定性,對于在RC 損傷修復(fù)縫合過程中應(yīng)用單排還是雙排固定技術(shù)目前仍存在爭議。 從長期效益來看,雙排修復(fù)技術(shù)確實可以提高肌腱的愈合速度并降低復(fù)發(fā)率。而由于成本效益的考慮和目前質(zhì)量不高的臨床證據(jù),不建議使用雙排技術(shù)修復(fù)所有的 RC 損傷過程[17]。

2.2 慢性肩袖肌腱損傷模型

慢性退行性勞損是目前臨床上最為常見的RC損傷誘因,RC 肌腱與肩峰或盂肱關(guān)節(jié)下表面的頻繁接觸被認為是RC 損傷的發(fā)病機制之一,因此實驗研究中主要使用肩峰下撞擊模型進行模擬[18],通過剪取同側(cè)肩胛骨的1 ～2 塊小骨塊移植固定到肩峰的下表面,模擬SSc 的肩峰撞擊過程。 然而有研究提出,肌腱的撞擊過程與RC 損傷之間并沒有直接聯(lián)系,可能并不是衰老相關(guān)退行性RC 病變的本質(zhì)[19]。 目前有研究通過微創(chuàng)的方式進行慢性RC損傷模型的制備,主要通過緊貼肩峰內(nèi)側(cè)刺入植入物,并于刺入后緊貼肩峰下表面行進, 至三角肌后緣從肩峰外側(cè)刺出[20]。 除此之外,也有研究采用A型肉毒素注射的方式進行模型制備[21]。

3 肩袖損傷動物模型的選擇

從目前的研究來看,肌腱韌帶等軟組織的損傷在外科臨床中一直缺乏有效的治療,乃至通過藥物等其他替代療法的干預(yù)中也顯得異常困難和復(fù)雜。其中最大的障礙便是缺乏成熟且標(biāo)準(zhǔn)量化的活體RC 損傷動物模型。 雖然曾有研究對多種實驗動物在肩袖損傷造模中的應(yīng)用進行評估[22-23]。 但實際上除人類以外,大多數(shù)動物都是依靠四肢支撐,即使存在偶爾的雙后肢支撐短暫站立行為,雙前肢仍需要發(fā)揮較多的承重功能。 因此,人類的肩部解剖結(jié)構(gòu)是極具特異性的,與大多數(shù)動物的軟組織結(jié)構(gòu)并不相似。 肩峰、喙肩弓以及通過其下方的韌帶結(jié)構(gòu)是RC 損傷模型的必要構(gòu)造。 另外,RC 損傷模型建立的過程中,應(yīng)滿足以下條件[24]：①RC 肌腱損傷后沒有自發(fā)性肌腱愈合或瘢痕形成的現(xiàn)象;②滑膜內(nèi)損傷炎癥環(huán)境存在;③有可用于人類縫合修復(fù)技術(shù)的肌腱大小;④存在可控的術(shù)后康復(fù)能力;⑤慢性肌腱損傷后能出現(xiàn)相關(guān)肌肉不可逆轉(zhuǎn)的萎縮、僵硬和脂肪浸潤。 我們通過閱讀相關(guān)文獻,針對RC損傷造模應(yīng)用過程中不同動物種類的優(yōu)缺點,歸納總結(jié)如表1,以便后期的研究人員基于具體的情況建立出更為合適的模型。

從表中我們不難看出,根據(jù)目前的實際情況,使用大鼠和兔來制備RC 肌腱損傷模型可基本滿足RC 損傷模型的選擇原則,是比較符合實際的建模動物。 對于兔RC 肌腱損傷模型來說,兔盂上結(jié)節(jié)下方中走行的SSc 肌腱是以類似于人類SS 的附著方式附著于肱骨小結(jié)節(jié),并在RC 損傷過程中會出現(xiàn)明顯的脂肪浸潤。 盡管目前大部分的實驗都集中于以兔SS 為造模對象,但已逐漸有使用SSc 造模的趨勢,因此我們更推薦將SSc 作為造模的首選干預(yù)肌腱。 大鼠模型手術(shù)操作成熟,成本低廉易獲取,但關(guān)節(jié)較小,組織處理時應(yīng)更加精細。 同時需要注意的是,由于大鼠與人類RC 組織高度相似的解剖學(xué)特征,大鼠模型對于SS 肌腱損傷機制介導(dǎo)的RC 肌腱損傷過程能夠很好的進行描述。 但在大鼠SS 肌腱損傷模型中并未有明顯的脂肪浸潤,有研究[37]提出大鼠IS 在損傷后經(jīng)歷著與人類相似的脂肪堆積和肌肉萎縮等病理過程,該模型可能是貼合人類SS 肌腱損傷的更好的動物模型。 對于早期退行性RC 損傷的動物模型選擇,犬類動物似乎要比綿羊和山羊更具有優(yōu)勢。 關(guān)節(jié)鏡下的肩部損傷犬模型更有利于觀察肩內(nèi)神經(jīng)肌肉組織病理和肌腱載荷能量的變化。

4 肩袖損傷動物模型的功能評估

在RC 肌腱損傷模型建立的過程中,組織學(xué)和行為學(xué)分析是衡量造模成功與否必不可少的條件。疼痛是RC 損傷后的典型癥狀,包括機械和觸覺異常性疼痛。 對于小型動物來說,可表現(xiàn)為步態(tài)異常、自發(fā)籠內(nèi)運動和攀爬行為增多、梳理行為以及食物和水的消耗量變化。 而對于那些大型動物,大多數(shù)的功能性測量比在大鼠等小型動物中更容易觀察到。 通常在我們的疼痛評估實驗室中,纖毛測痛儀機械痛和熱輻射痛實驗中所反應(yīng)出的數(shù)值主觀性較低。 另外某些測試中由刺激引起的行為變化也被廣泛用作疼痛的量化指標(biāo)。 比如可通過樓梯實驗用以評估前肢的精細運動控制[38]。 同時在使用這些測試時,有些實驗主觀性較強,通常憑借斜眼、四肢縮回或發(fā)聲來識別那些處于疼痛狀態(tài)的動物[39]。 因此需要盡可能引入某些客觀參數(shù),來補償主觀性較高情況下所缺乏的可靠性和可重復(fù)性,如食物和水的攝入量、體重和體溫的變化、肌肉的

圍度和體積等。 除此之外步態(tài)分析依舊是評定動物運動行為的有效方式,雖然嚙齒類動物的四足步態(tài)和人類雙足步態(tài)之間存在明顯差異,但患病后二者均表現(xiàn)出相似的補償性步態(tài)模式。 有研究曾描述了一種新開發(fā)的步態(tài)分析方法,該方法可以輕松量化大量運動參數(shù)。 通過使用墨水標(biāo)記測量單個爪印的特征和爪印之間的距離,以提供時間和空間步態(tài)數(shù)據(jù)。 健康的嚙齒類動物以平衡對稱的步態(tài)行走,步長的縮短表明外展能力可能受損。 步幅寬度的減少表明,嚙齒類動物通過重新分配,將體重轉(zhuǎn)移到其他三條腿來保護受傷的肢體,從而對受傷的肢體進行補償。 這類似于在兩足動物中觀察到的跛行。 爪印之間角度的改變是由過度的旋前或旋后引起的,這可能表明關(guān)節(jié)的活動障礙[40-41]。

表1 不同種類動物模型優(yōu)缺點Table 1 Advantages and disadvantages of different animal models

5 總結(jié)

目前沒有任何一種動物模型能夠完全模擬臨床上的RC 病變,大鼠和兔仍是最常用的兩種造模動物。 人類與大型動物(尤其是靈長類動物)由于在解剖學(xué)上的相似性,可以對手術(shù)技術(shù)和相關(guān)問題進行有力的評估,而小型動物更適合研究影響RC損傷和修復(fù)的多種生物學(xué)因素。 單一的從撞擊或缺血退變病因的角度探討RC 損傷機制可能較為局限。 RC 撕裂的發(fā)生發(fā)展也可能導(dǎo)致肱骨頭上半脫位,最終導(dǎo)致整個肩部的功能障礙。 慢性RC 撕裂與肌肉本身結(jié)構(gòu)變化關(guān)系更為密切,例如肌肉體積的喪失和脂肪的堆積,同時也受RC 肌腱微血管供應(yīng)的影響。 因此對于RC 損傷動物模型的研究應(yīng)注重整體與局部的聯(lián)系,臨床生物力學(xué)模型的開發(fā)為RC 損傷提供了一定思路,具有較好的應(yīng)用前景。進一步了解肩袖肌腱損傷的細胞和分子途徑、肌腱生理病理學(xué)以及關(guān)節(jié)生物力學(xué),有利于以后開發(fā)出更為成熟的動物模型。