高尿酸血癥及并其發(fā)癥大鼠模型的建立

陳林軍,楊焱,吳迪,陳萬超,董國超,喬徐馨,吳春燕,李婷婷,3*

(1. 上海健康醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院,上海 200237; 2. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,上海 201403;3. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

近年來,隨著生活水平的提高,我國居民的生活習(xí)慣和膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生很大改變,高嘌呤和高糖食物攝入的不斷增加。 我國高尿酸血癥患病率已達(dá)13.7%,發(fā)病年齡呈低齡化,高尿酸血癥及其并發(fā)癥發(fā)病率呈逐年上升趨勢。 尿酸是人類嘌呤代謝的最終產(chǎn)物,當(dāng)血中尿酸水平大于420 μmol /L(7 mg/dL)時即定義為高尿酸血癥[1-3]。 尿酸鹽在關(guān)節(jié)腔和組織中沉積,進(jìn)而引發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性腎病,高尿酸血癥已是當(dāng)前影響人類健康的一種嚴(yán)重的代謝性疾病[4]。 因此建立穩(wěn)定的高尿酸血癥及肝腎損傷動物模型,對人類預(yù)防高尿酸血癥、篩選相關(guān)治療藥物尤為重要。

人類由于缺乏尿酸酶,因而尿酸是嘌呤代謝的最終產(chǎn)物。 但是其他大多數(shù)哺乳動物體內(nèi)固有尿酸酶,可將尿酸降解為尿囊素而隨尿液排出體外,故大多數(shù)動物體內(nèi)血尿酸值較低,建立高尿酸血癥的動物模型是非常困難的[5]。 迄今為止,高尿酸造模方法存在觀察周期較短,不穩(wěn)定的問題,國內(nèi)外尚無公認(rèn)的高尿酸血癥動物模型。 本研究采用給予尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀,同時增加體內(nèi)尿酸前體(次黃嘌呤、酵母)的量,以及高果糖攝入同時抑制腎小管尿酸的分泌聯(lián)合造模的方法,通過五個動物模型組篩選大鼠血清尿酸升高并維持較長時間的建模方法。 通過大鼠血清中尿酸(uric acid,UA)、尿素(urea,Urea)、肌酐(creatinine,Cr)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)等水平的檢測來考察與評價其建立持續(xù)、穩(wěn)定的高尿酸動物模型的可行性,并同時對大鼠踝關(guān)節(jié)組織、腎組織形態(tài)學(xué)觀察來比較不同高尿酸血癥造模法對腎、踝關(guān)節(jié)繼發(fā)性損傷的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級雄性 Sprague-Dawley 大鼠(下稱 SD 大鼠)48 只,(6 ± 1)周齡,體重(190 ± 10)g,購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司【SCXK(滬)2019-0812】,飼養(yǎng)在上海健康醫(yī)學(xué)院實驗動物中心【SYXK(滬)2018-0029】,室溫維持 25℃恒溫,動物自由飲水及攝食。 所有操作均根據(jù)美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)發(fā)布的實驗室動物護(hù)理和使用指南(8th Edition, 2011, ISBN 10： 0-309-15400-6)進(jìn)行且均符合上海健康醫(yī)學(xué)院動物實驗倫理學(xué)要求(審批號：2019-HXXM-05-3048)。

1.1.2 試劑與儀器

氧嗪酸鉀(Potassium Oxonate,PO,阿拉丁,P137112);次黃嘌呤(Hypoxanthine,H,H108384);酵母膏(Yeast extract,YE,Y110984);鹽酸乙胺丁醇片(EMB,特一藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,國藥準(zhǔn)字H44023635);普通大鼠飼料(遼寧省沈陽前民動物實驗飼料廠,GB14924.3-2010);氧嗪酸鉀聯(lián)合酵母混合飼料(2%氧嗪酸鉀,12%酵母膏,定制于北京博泰宏達(dá)生物);尿酸試劑盒(尿酸酶法、CH0101054、邁克生物股份有限公司);尿素試劑盒(尿素酶-谷氨酸脫氫酶法、CH0101051、邁克生物股份有限公司)等。

離心機(eppendorf,centrifuge 5424,美國),全自動生化分析儀(HITACHI,7080 Automatic Analyzer,日本), PRECICE 全自動數(shù)字切片掃描系統(tǒng)(PRECICE 500,北京優(yōu)納科技有限公司,中國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

將48 只雄性 Sprague-Dawley 大鼠(下稱 SD 大鼠)隨機分為6 組(每組8 只),分別為空白對照組(Control 組)、氧嗪酸鉀組(OA 組)、氧嗪酸鉀+次黃嘌呤組(OA+H 組)、氧嗪酸鉀+酵母膏組(OA + YE組)、10%果糖+乙胺丁醇組(10% Fru + 0.2% EMB組)、2%氧嗪酸鉀聯(lián)合12%酵母特殊飼料組(OA PO組)。 所有動物適應(yīng)生活環(huán)境,自由進(jìn)食和飲水,1周后開始實驗。

1.2.2 造模方法

Control 組給予正常飼養(yǎng),OA 組給予250 mg/(kg·d)氧嗪酸鉀腹腔注射,OA + H 組給予氧嗪酸鉀 250 mg/(kg·d)聯(lián)合次黃嘌呤 100 mg/(kg·d)腹腔注射, OA + YE 組給予氧嗪酸鉀250 mg/(kg·d)腹腔注射聯(lián)合酵母膏3.5 mL/(kg·d)灌胃,除OA PO 組喂食氧嗪酸鉀聯(lián)合酵母特殊飼料,10% Fru +0.2% EMB 組飲用果糖加乙胺丁醇的水外,其余組別SD 大鼠均攝取正常飼料和飲用正常水,造模方法詳見表1。 每周尾部采血1 次,連續(xù)造模5 周。

1.2.3 檢測指標(biāo)及處理

采血前12 h 禁食、不禁水,每周對SD 大鼠尾部靜脈抽血每只0.5 mL,37℃水浴30 min,以3000 r/min 離心 15 min,取血清 200 μL,按照尿酸、尿素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒(maccura,上海)的操作說明,并采用自動生化儀測定血清中各生化指標(biāo)的水平。

1.2.4 大鼠腎及關(guān)節(jié)病理組織學(xué)檢查

大鼠處死后,取全腎及膝關(guān)節(jié),全腎用生理鹽水清洗后,浸泡在福爾馬林溶液中固定。 SD 大鼠膝關(guān)節(jié)浸潤EDTA 脫鈣液中12 d,達(dá)到用針可以輕松刺穿的程度后,進(jìn)行固定。 取肝、腎、膝關(guān)節(jié)組織進(jìn)行脫水、石蠟包埋、制片(4 μm)、HE 染色、利用PRECICE 全自動數(shù)字切片掃描系統(tǒng)觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS Statics 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用單因素方差分析,以P＜0.05 表示差異有顯著性;P＜0.01 表示差異極具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察

空白組大鼠飲食正常,毛色光滑,反應(yīng)靈敏,體重正常;5 個造模組隨著時間的推移,體重相對空白對照組有明顯減輕,毛色發(fā)黃,食量減少,排尿量明顯增多,且1 月后造模組開始出現(xiàn)大鼠踝關(guān)節(jié)紅腫等炎癥,腳踝行動不靈活現(xiàn)象,且OA PO 組大鼠體重減輕最明顯,精神萎靡,易怒,且腳踝腫脹程度明顯高于其他造模組。

2.2 大鼠血清中尿酸值、尿素值變化

2.2.1 不同造模組大鼠血清中尿酸值變化

與空白組相比較,除OA PO 組外,其余模型組尿酸值總體沒有升高反而略微有所降低,無統(tǒng)計學(xué)意義;建模 1 周,模型組 OA、OA + H、OA + YE、10%Fru + 0.2% EMB 與空白組接近,OA PO 組尿酸反而降低,可能是氧嗪酸鉀作為一種尿酸酶的競爭性抑制劑,大鼠體內(nèi)尿酸濃度快速升高時,可能反饋性促進(jìn)尿酸酶的表達(dá)或者活性增加[6];建模5 周,OA PO 組尿酸值與空白組比較有顯著的升高,且差值具有統(tǒng)計學(xué)意義;OA、OA + H、OA + YE、10% Fru+ 0.2% EMB 模型組與空白組相比較尿酸值持續(xù)降低,出現(xiàn)模型組尿酸值不升高反而降低的異常現(xiàn)象,可能與大鼠體內(nèi)的尿酸酶活力反饋性升高有關(guān)。 (見表1)

2.2.2 不同造模組大鼠血清生化指標(biāo)的比較

血尿素(Urea)與肌酐(Cre)都是反應(yīng)腎功能的重要指標(biāo),丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)是反映肝功能的生化指標(biāo)[7]。造模5 周后,各組實驗終點時血清生化指標(biāo)見圖1。造模組的血清肌酐和尿素氮水平明顯低于健康對照組,氧嗪酸鉀聯(lián)合酵母特殊飼料組(OA PO 組)血清中肌酐、尿素水平大幅提升,伴有嚴(yán)重的腎損傷,血肌酐水平顯示已經(jīng)出現(xiàn)腎衰現(xiàn)象。 同時,丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平顯著降低,說明肝也伴有明顯損傷。 其他各模型組尿素氮和肌酐與對照組相比,氧嗪酸鉀 + 次黃嘌呤組(OA+ H 組) 尿素水平有顯著升高,腎出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷。氧嗪酸鉀組(OA 組)、氧嗪酸鉀+次黃嘌呤組(OA +H 組) 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶有降低,肝出現(xiàn)損傷。10%果糖+乙胺丁醇組(10%Fru + 0.2%EMB 組)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平降低,肝也出現(xiàn)損傷。

表1 每周各組大鼠血清中尿酸水平變化(μmol/L,n=8)Table 1 Changes of serum uric acid level in rats of each group every week(μmol/L,n=8)

2.3 大鼠肝及關(guān)節(jié)病理形態(tài)學(xué)觀察

2.3.1 大鼠肝形態(tài)觀察及HE 染色

大鼠肝組織大體標(biāo)本見圖2,肉眼觀察可見,空白對照組肝為棕紅色,包膜光滑,質(zhì)地柔軟;模型組肝顏色略微發(fā)黃,肝體積有增大,質(zhì)地變硬,OA PO組較為嚴(yán)重。 大鼠肝組織HE 染色顯示,空白對照組未見肝細(xì)胞脂肪變性,未見明顯炎癥性細(xì)胞浸潤;模型組 OA 組、OA + H 組、OA + YE 組、OA PO組局部肝匯管區(qū)可見少量炎癥細(xì)胞浸潤,說明OA組、OA + H 組、OA + YE 組、OA PO 組對 SD 大鼠腎均有不同程度損傷,其中氧嗪酸鉀混合飼料組損傷最嚴(yán)重。

注：大鼠在實驗終點時血清生化指標(biāo)與Control 組比較,*P ＜0.05,** P ＜0.01,***P ＜0.001。圖1 大鼠在實驗終點時血清生化指標(biāo)的比較Note. Compared with Control group, *P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01,***P ＜ 0.001.Figure 1 Comparison of serum biochemical indicators in rats at the end of experiment

圖2 各組大鼠的肝及HE 染色病理切片(箭頭：炎細(xì)胞浸潤)Figure 2 Livers and HE stained pathological sections of rats in each group(Arrows indicate inflammatory cell infiltration)

2.3.2 大鼠腎形態(tài)觀察及HE 染色

大鼠腎組織大體標(biāo)本見圖3,肉眼觀察可見,空白對照組腎色暗紅,表面光滑,外觀無腫脹造;模組腎均有肥大,呈鼓型,腎色發(fā)黃,OA PO 組尤為嚴(yán)重,且外觀表面細(xì)顆粒狀。 對大鼠腎組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢查,根據(jù)HE 染色顯示,空白對照組大鼠腎結(jié)構(gòu)正常,腎小球大小正常,腎小管結(jié)構(gòu)清晰完整,無異變,無結(jié)晶積累,間質(zhì)內(nèi)未見異常; OA、OA +H、OA + YE 各模型組均出現(xiàn)腎小球內(nèi)不同程度的尿酸鈉鹽結(jié)晶沉積,腎小管排列不規(guī)則不明顯,OA + H組腎小管周圍炎性細(xì)胞浸潤;模型10% Fru + 0.2%EMB 組有少量的尿酸鈉鹽沉積,腎小管局部擴張;模型OA PO 組腎小球硬化,內(nèi)有大量的尿酸鈉鹽結(jié)晶積累,間質(zhì)嚴(yán)重擴張,所有腎小球發(fā)生病變,腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)空泡非常明顯,說明OA 組、OA + H 組、OA + YE 組、OA PO 組對SD 大鼠腎都有不同程度損傷,且氧嗪酸鉀混合飼料損傷最嚴(yán)重。

2.3.3 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜肌組織病理學(xué)觀察

滑膜是關(guān)節(jié)囊內(nèi)的一層很薄的組織,當(dāng)關(guān)節(jié)內(nèi)部受到刺激時,滑膜就會首先發(fā)生炎性反應(yīng),引起積液、發(fā)熱腫大等癥狀運動表現(xiàn)欠佳,導(dǎo)致關(guān)節(jié)屈伸困難。 痛風(fēng)性滑膜炎,正是因為尿酸結(jié)晶這一刺激物,沉積至滑膜所引起的[8]。 選取空白對照組及OA、OA + H、OA + YE、10% Fru + 0.2% EMB、OA PO 各模型組的踝關(guān)節(jié)滑膜肌進(jìn)行病理組織學(xué)檢查(圖4),根據(jù)HE 染色顯示,空白對照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜 2 ～ 5 層排列規(guī)整、緊致、有序; OA、OA + H、OA+ YE、10% Fru + 0.2% EMB、OA PO 各模型組關(guān)節(jié)滑膜增厚,排列散亂、無序、松散,其中OA + YE 組有大量的中性粒細(xì)胞浸潤,其他模型組有輕微炎癥細(xì)胞,這與造模組大鼠腳踝出現(xiàn)紅腫炎癥表象一致。 雖然 OA、OA + H、OA + YE、10% Fru + 0.2%EMB 模型組尿酸值波動幅度小,且有幾個時間段尿酸值有略微降低。 但是大鼠取材前已出現(xiàn)步態(tài)異常,踝關(guān)節(jié)腫脹,病理觀察也出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤等關(guān)節(jié)炎癥狀[9]。 吳燕升等[10]研究報道,氧嗪酸鉀造模后,大鼠會出現(xiàn)一個短暫性的尿酸升高隨后降低的現(xiàn)象,一般會在12 h 內(nèi)恢復(fù)到正常水平。 所以我們推斷由于大鼠體內(nèi)尿酸酶的作用,OA、OA + H、OA+ YE、10% Fru + 0.2% EMB 這 4 個模型組 12 h 后大鼠血清尿酸值降低,檢測不到高尿酸,但是踝關(guān)節(jié)已經(jīng)出現(xiàn)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎癥狀。

注： 紅色箭頭：尿酸鈉沉積結(jié)晶;黑色箭頭：病變腎小管;藍(lán)色箭頭：病變腎小球。圖3 各組大鼠的腎及HE 染色病理切片Note. Red arrow, deposition and crystallization of sodium uric acid. Black arrow, diseased renal tubules. Blue arrow,diseased glomeruli.Figure 3 Kidney and HE stained pathological sections of rats in each group

圖4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜肌組織HE 染色病理切片(圈出部分為大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織)Figure 4 HE stained pathological sections of of ankle joints in rats of each group(Circled portion is synovial tissue from rat ankle)

采用氧嗪酸鉀聯(lián)合酵母特殊飼料組(2%氧嗪酸鉀,12%酵母膏),第5 周已經(jīng)達(dá)到維持較長時間的高尿酸水平。 通過腎組織、踝關(guān)節(jié)HE 染色,腎組織腎小球內(nèi)有大量尿酸鈉晶體沉積,腎小管上皮細(xì)胞可見明顯的胞質(zhì)空泡,排列紊亂,管腔擴張,說明腎損傷非常嚴(yán)重,關(guān)節(jié)滑膜略微增厚,排列散亂,少量中性粒細(xì)胞浸潤。 與其他模型組相比,氧嗪酸鉀混合飼料組血尿酸、血尿素、血肌酐、腎損傷效果都較為明顯。 且建模方法更接近人類痛風(fēng)疾病的發(fā)病機制,可以最大程度上的模擬臨床上形成的痛風(fēng)癥狀有利于研究人類高尿酸相關(guān)疾病的發(fā)病機制以及治療藥物靶點的設(shè)計。

3 討論

建立高尿酸血癥動物模型,主要通過增加尿酸來源、抑制尿酸排出、抑制尿酸酶的活性來進(jìn)行[11-12]。 本實驗建立了5 種造模方法,氧嗪酸鉀組(OA)、氧嗪酸鉀 + 次黃嘌呤組(OA + H)、氧嗪酸鉀+酵母膏組(OA + YE)、10%果糖 + 0.2%乙胺丁醇組(10% Fru + 0.2% EMB)這四種造模方法均未能形成持續(xù)穩(wěn)定的高尿酸模型,造模可行性較小。其原因可能是氧嗪酸鉀所誘導(dǎo)的動物體內(nèi)尿酸水平在一日內(nèi)并不穩(wěn)定,且SD 大鼠尾部靜脈采血時間延時很長,不能保證在同一時間點給全部模型組采血,個體也存在差別,導(dǎo)致尿酸值有較大的差異。給予SD 大鼠氧嗪酸鉀+酵母混合飼料,成功的誘導(dǎo)了大鼠高尿酸血癥合并肝腎損傷模型。 大鼠體內(nèi)存在尿酸酶,所以大鼠高尿酸模型往往存在不穩(wěn)定的問題,氧嗪酸鉀是目前國內(nèi)外最常用的高尿酸血癥造模藥物。 Yukio 等[13]每隔兩小時連續(xù)腹腔注射給予大鼠250 mg/kg 的氧嗪酸鉀,可明顯提高血中尿酸水平,但是尿酸值隨后很快降低。 有報道稱果糖可致血尿酸迅速升高,且果糖是目前唯一已知的可增加血尿酸的糖類,乙胺丁醇也可作為抑制尿酸排泄的藥物[14]。 本實驗使用了果糖聯(lián)合乙胺丁醇造模,但是5 周依然沒有成穩(wěn)定的高尿酸模型。 本實驗建立的氧嗪酸鉀聯(lián)合酵母特殊飼料的高尿酸模型,與人類痛風(fēng)臨床現(xiàn)象高度相似,大大提高了模型的穩(wěn)定性以及可重復(fù)性,減少了灌胃、注射等實驗難度,并且能更好的模仿人類高尿酸的發(fā)病過程,且該方法操作簡便,穩(wěn)定,易于操作。

本研究使用氧嗪酸鉀、酵母膏等建立高尿酸血癥動物模型,從生化以及病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)OA PO 混合飼料組尿酸值升高且維持較長時間,腎、心臟等器官發(fā)生病變,是一種高效、便利的高尿酸血癥聯(lián)合腎損傷的動物模型,極具研究價值和醫(yī)療用途前景。 據(jù)統(tǒng)計,我國高尿酸患者目前已經(jīng)達(dá)1.2 億,痛風(fēng)患者8000 萬人,且患病人數(shù)逐年增加[15-16]。 目前,國內(nèi)外還沒有有效的治療痛風(fēng)的藥物,動物疾病模型在研究人類致病機理中起到了關(guān)鍵作用,該模型的建立對高尿酸藥物的預(yù)防及藥物的篩選及開發(fā)有著非常重要的意義。