腸易激綜合征內(nèi)臟高敏模型不同制作方法的比較研究

張薇,趙映,鄭倩華,黎明,張健強,李瑛,蔡定均

(成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,成都 610072)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是臨床常見的功能性腸病,以腹痛、排便習(xí)慣改變及糞便性狀異常為主要臨床表現(xiàn)[1]。 流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),IBS 影響約11%的全球人口,在中國IBS 患病率為0.82% ～ 11.5%[2]。 現(xiàn)代研究表明 IBS 的發(fā)病與內(nèi)臟感覺過敏、胃腸動力學(xué)失常、精神因素、感染因素等相關(guān)[3]。 其中內(nèi)臟高敏作為IBS 最主要的病變特征之一,其主要表現(xiàn)為內(nèi)臟組織對生理性刺激及傷害性刺激的敏感性及反應(yīng)性增強[4]。 在課題組前期研究中發(fā)現(xiàn),IBS 內(nèi)臟高敏的造模方法較多,雖各有優(yōu)勢,但都缺乏對模型內(nèi)臟高敏狀態(tài)的穩(wěn)定性和持續(xù)性進行深入研究。 另外,目前研究IBS 內(nèi)臟高敏所使用的幼鼠模型最常用的造模方法為新生期母嬰分離(neonatal maternal separation,NMS)法[5-6],然而這種造模方式尚不完善[7],且刺激因素相對單一。 因此,我們將NMS 造模方法與慢性不可預(yù)測性應(yīng)激[8]當中的時間應(yīng)激相結(jié)合,并把此模型稱之為不可預(yù)測性母嬰分離模型,將其與傳統(tǒng)母嬰分離模型相比較,評估內(nèi)臟高敏性及穩(wěn)定性和持續(xù)性上有何異同,為IBS 內(nèi)臟高敏幼鼠模型的研究和該病的相關(guān)治療研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

2 日齡清潔級SD 大鼠30 只,雌雄各半,體重(8± 2.5)g,由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心提供【SCXK(川)2019-11】,動物在成都中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實驗動物中心飼養(yǎng)【SYXK(川)2019-049】,室內(nèi)溫度18 ～24℃,濕度50% ～70%,晝夜節(jié)律12 h：12 h。 所有操作均符合成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗倫理學(xué)要求(成都中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理備案號：2019-06),并且實驗操作過程中按實驗動物使用的3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 試劑與儀器

二甲苯(AR 級),批號：20181020,福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司;蘇木素染液,批號：G1005-1,武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司;伊紅染液,批號：G1001,武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司;鹽酸(AR級),批號：20180118,成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn);中性樹膠,批號：BL704 A,Biosharp 生物公司;轉(zhuǎn)輪式切片機(徠卡-2016,德國);TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機(常州市中威電子儀器有限公司,中國);BMJ-Ⅲ型包埋機(常州郊區(qū)中威電子儀器廠,中國);PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司,中國);數(shù)碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital,麥克奧迪實業(yè)集團有限公司,中國);圖像分析軟件 Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics 公司,美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

每只幼鼠與哺乳母鼠共同飼養(yǎng)于塑料籠內(nèi),幼鼠在出生后第22 天斷奶,第30 天分籠,并進行雌雄分離。 哺乳母鼠自由進食與飲水。 采用隨機數(shù)字表將幼鼠隨機分成母嬰分離組(A 組)、不可預(yù)測性母嬰分離組(B 組)和空白對照組(C 組),每組10只,雌雄各半。

1.2.2 腸易激綜合征內(nèi)臟高敏性模型的建立

A 組：乳鼠在出生后2 ～21 d 每天與母鼠分離3 h(9：00-12：00)。 B 組：乳鼠在出生后 2 ～ 21 d每天與母鼠分離3 h,每天隨機安排分離時間刺激,分離時間段為：①9：00-12：00;②14：00-17：00;③19：00-22：00,且每個分離時間段不連續(xù)出現(xiàn)3 d,使動物不能預(yù)料分離刺激的發(fā)生。 C 組：乳鼠在出生后2 ～21 d 與母鼠一直共同飼養(yǎng),不做任何分離處理。

1.2.3 觀察指標

(1)一般情況

造模結(jié)束后,在大鼠 5 周齡、7 周齡、9 周齡和11 周齡時對所有組別的大鼠進行體重測量,并且觀測所有組別大鼠的精神狀態(tài)、皮毛色澤、活動度及進食量,并將以上指標作詳細記錄。 進食量檢測方法為：將各組大鼠進行單籠飼養(yǎng),稱取24 h 前后飼料重量,進食量(g)=原有飼料量(g)-剩余量(g)。

(2)大便情況

造模結(jié)束后,在大鼠11 周齡時觀測各組大鼠的大便顆數(shù)及糞便性狀,采用Bristol 大便分型量表[9]判斷糞便性狀,評分標準為：1 分,分離的硬團;2 分,團塊狀;3 分,干裂的香腸狀;4 分,柔軟的香腸狀;5 分,軟的團塊;6 分,泥漿狀;7 分,水樣便。 并測定糞便含水量,方法如下：對所有組別大鼠分籠單只飼養(yǎng),在自由進食與飲水的情況下,每隔2 h 收集各組大鼠糞便一次,共收集12 h 糞便,使用電子天平稱秤得濕重后,放入50℃烤箱內(nèi)烘烤6 h 后,取出稱干重,計算糞便含水量。 含水量=(濕重-干重)× 100%。

(3)內(nèi)臟高敏測定

造模結(jié)束后,在大鼠 5 周齡、7 周齡、9 周齡和11 周齡時進行不同壓力下結(jié)直腸擴張(colorectal distention,CRD) 刺激, 并使用腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex,AWR)評分及內(nèi)臟痛閾值進行評價,以評估其內(nèi)臟敏感性。

中國國有企業(yè)大致分為三類：一是中央所屬的工業(yè)企業(yè)（特殊行業(yè)的不算），即“中央企業(yè)”（狹義）； 第二類是中央所屬的非工業(yè)企業(yè)和特殊行業(yè)的工業(yè)企業(yè)，這類企業(yè)被財政部稱為“中央企業(yè)”（廣義），不但包括中央所屬的金融機構(gòu)，如四大國有商業(yè)銀行、煙草總公司、鐵路總公司等巨無霸企業(yè)，也包括各中央部委所屬的林林總總的企業(yè)，甚至某部委機關(guān)服務(wù)中心下屬的地下室招待所、印刷廠都在其中；第三類是地方政府出資成立的國有企業(yè)，按屬地原則由當?shù)卣鶎俚膰Y委或指派特定機構(gòu)履行出資人職責。說明一下，地方國資委與國務(wù)院國資委無直接隸屬關(guān)系，它們歸地方政府管。

腹壁撤退反射評分：實驗前24 h 禁食但不禁水,單手抓握大鼠后輕揉其肛口,排盡糞便后,用少量乙醚麻醉。 將麻醉后的大鼠放入自制的大鼠固定器中(清醒后大鼠在該固定器中只能上下運動,無法前后活動及轉(zhuǎn)身),將涂抹石蠟油的球囊導(dǎo)管輕柔插入大鼠肛門,使球囊末端距肛門約1 cm,并用膠帶將導(dǎo)管與鼠尾根部固定。 待大鼠清醒并能適應(yīng)環(huán)境后,向球囊內(nèi)迅速充氣,使球囊擴張壓在短時間內(nèi)分別達到 20、40、60 和 80 mmHg。 每個壓力梯度保持30 s,并觀察記錄AWR 評分。 使用腹壁撤退反射評分,評分標準：0 分：給予擴張刺激時大鼠的情緒基本穩(wěn)定;1 分：給予擴張刺激時大鼠變的相對不穩(wěn)定,偶爾扭動頭部;2 分：腹背部肌肉輕微收縮但腹部未抬離地面;3 分：腹背部肌肉強烈收縮并把腹部抬離地面;4 分：腹部肌肉強烈收縮,腹部呈弓形并把腹部、會陰部抬離地面[10]。 每次檢測重復(fù)3 次,評分過程采用盲法評價,避免人為的主觀影響。

內(nèi)臟痛閾值：將大鼠放入固定器中并插入球囊導(dǎo)管(方法與腹壁撤退反射一致),向球囊內(nèi)迅速充氣,壓力從0 mmHg 每次勻速遞增5 mmHg,每次擴張持續(xù)30 s 以觀察大鼠的反應(yīng),待大鼠安靜l min后,反復(fù)多次加壓直至大鼠腹部抬起和背部拱起(即AWR 評分為3 分)時的最低壓力值作為內(nèi)臟痛閾值[11]。 每個壓力值重復(fù)3 次檢測,取平均值整個檢測過程中為防止球囊對大鼠腸粘膜有所損害,球囊壓力控制在0 ～80 mmHg 之間。

(4)大鼠結(jié)腸組織病理觀察

在上述檢測結(jié)束后,使用頸椎脫臼法處死大鼠后,迅速取距肛門4 ～5 cm 處約1 cm 的遠端結(jié)腸,用4%多聚甲醛中固定,石蠟包埋,切片,用蘇木精-伊紅染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察切片：炎性細胞(主要是中性粒細胞)在全層中浸潤化及浸潤的程度,各細胞間質(zhì)之間的水腫情況,并根據(jù)結(jié)腸病理組織評價炎癥分級[12]標準進行評分,如表1 所示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。 首先對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性分析,符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用平均值± 標準差()描述,采用單因素方差分析進行比較。 由于多個時間點比較,故組間和組內(nèi)差異同時采用重復(fù)測量進行比較。 不滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用中位數(shù)(P25,P75)描述,采用秩和檢驗進行比較,以P ＜0.05 表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

由表2 中所示,各組大鼠間體重無顯著性差異(P＞0.05)。 由于不同性別大鼠在發(fā)育過程中體重增長會存在差異,因此我們對各組同性別大鼠的體重做了比較,結(jié)果顯示在7 周齡及11 周齡時,各組同性別大鼠間體重無顯著性差異(P＞0.05)(見圖1)。 此外,與C 組比較,A 組和B 組大鼠精神較差,毛發(fā)枯黃無光澤,活動減少,且進食量也有所減少(表3)。

表1 結(jié)腸病理組織評價炎癥分級Table 1 Evaluation of colonic pathological tissue inflammation grade

2.2 大便情況

表2 不同時間點各組大鼠體重比較( , n =10, g)Table 2 Comparison of the weight of rats in different groups at different time points( , n =10, g)

表2 不同時間點各組大鼠體重比較( , n =10, g)Table 2 Comparison of the weight of rats in different groups at different time points( , n =10, g)

組別Groups 5 周齡5 weeks 7 周齡7 weeks 9 周齡9 weeks 11 周齡11 weeks母嬰分離組Neonatal maternal separation group 121.52 ± 13.63 136.58 ± 4.69 240.67 ± 60.01 296.76 ± 74.02不可預(yù)測性母嬰分離組Unpredictable neonatal maternal separation group 135.47 ± 13.37 133.47 ± 8.31 215.73 ± 49.83 294.34 ± 74.77白對照組Control group 130.72 ± 12.11 138.63 ± 11.25 195.00 ± 39.92 287.78 ± 64.12 P 0.069 0.406 0.149 0.958

注：與空白對照組大鼠比較,*P＜0.05,#P＜0.05。圖1 各組間同性別大鼠在不同年齡段的體重(g)比較Note. Compared with the Control group,*P＜0.05,#P＜0.05.Figure 1 Comparison of body weight (g) of rats of the same sex between different groups at different ages

表3 各組大鼠進食量比較( , n =10, g)Table 3 Comparison of food intake of rats in each group( , n =10, g)

表3 各組大鼠進食量比較( , n =10, g)Table 3 Comparison of food intake of rats in each group( , n =10, g)

注：與空白對照組比較,*P＜0.05。Note. Compared with Control group,*P＜0.05.

組別Groups 5 周齡5 weeks 7 周齡7 weeks 9 周齡9 weeks 11 周齡11 weeks母嬰分離組Neonatal maternal separation group 4.00 ± 0.000 4.20 ± 1.033 2.80 ± 1.135* 3.60 ± 0.966不可預(yù)測性母嬰分離組Unpredictable neonatal maternal separation group 4.60 ± 0.843 3.80 ± 1.033 2.40 ± 1.647* 4.20 ± 1.033空白對照組Control group 4.60 ± 0.843 4.40 ± 0.966 4.40 ± 0.966 5.00 ± 0.000

表4 各組大鼠大便顆粒數(shù)、性狀及含水量比較( , n =10)Table 4 Comparison of the number of stool particles, characters and water content of rats in each group( , n =10)

表4 各組大鼠大便顆粒數(shù)、性狀及含水量比較( , n =10)Table 4 Comparison of the number of stool particles, characters and water content of rats in each group( , n =10)

注：與空白對照組比較,*P＜0.05;與不可預(yù)測性母嬰分離組比較,▲P＜0.05。 (下表同)Note. Compared with Control group,*P＜ 0.05. Compared with unpredictable neonatal maternal separation group,▲P＜ 0.05.(The same in the following Tables)

組別Groups大便顆粒(顆)Stool particles(Pieces)大便性狀(分)Stool characteristics(marks)糞便含水量(%)Fecal water content(%)母嬰分離組Neonatal maternal separation group 6.400 ± 5.720▲ 4.323 ± 0.74 1.124 ± 1.160▲不可預(yù)測性母嬰分離組Unpredictable neonatal maternal separation group 15.700 ± 8.520* 3.887 ± 0.35 2.581 ± 1.190*空白對照組Control group 6.900 ± 5.950▲ 3.847 ± 0.27 0.789 ± 0.700▲

2.3 內(nèi)臟高敏測定

2.3.1 腹壁撤退反射評分

由圖 2 所示,與 C 組相比,A 組及 B 組大鼠AWR 評分更高,且在9 周齡時達到峰值,而在11 周齡,A 組及B 組大鼠AWR 評分較之前降低。 此外,各組同周齡大鼠AWR 評分比較,在5 ～9 周齡期間,以A 組大鼠的AWR 評分最高。

2.3.2 內(nèi)臟痛閾值

由表5 所示,與 C 組比較,在5 ～ 9 周齡期間,A組和B 組引起腹部抬起與背部拱起的壓力值更低,但是在11 周齡時痛閾值較C 組更高。

2.4 大鼠結(jié)腸組織病理觀察

如圖3 所示,A 組和B 組動物結(jié)腸組織形態(tài)較為完整,分層較為明顯,結(jié)構(gòu)清晰;黏膜層結(jié)構(gòu)完整,單層柱狀上皮細胞排列緊密,形態(tài)正常,胞質(zhì)染色均勻,胞核輪廓清晰,未見變性或壞死脫落,部分動物固有層內(nèi)少量腸腺出現(xiàn)變性壞死,長單管狀結(jié)構(gòu)消失,少量炎細胞呈小灶狀聚集,包括中性粒細胞及淋巴細胞;間質(zhì)內(nèi)未見明顯水腫;黏膜下層可見少量炎細胞散在分布;黏膜下層、肌層和外膜連接緊密,結(jié)構(gòu)完整清晰,其他未見明顯病理變化。 C組未見異常。 最后統(tǒng)計結(jié)果顯示,與C 組相比,A組和B 組病理評分稍有升高,但均不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

本研究將新生期母嬰分離的造模方法與慢性不可預(yù)測性應(yīng)激當中的時間應(yīng)激相結(jié)合,制作了不可預(yù)測性母嬰分離模型。 旨在將母嬰分離這一種單一因素的造模方法與其他刺激因素相結(jié)合,更能體現(xiàn)出IBS 發(fā)病復(fù)雜性的特點。 同時,大量實驗中母嬰分離模型的分離時間相對固定(一般為上午)[13-14],此分離時間存在局限性,易對幼鼠產(chǎn)生耐受,故我們在母嬰分離模型中加入了時間隨機這一不可預(yù)測性應(yīng)激刺激,使幼鼠不能提前感知母嬰分離刺激的到來,不易產(chǎn)生耐受。

注：與空白對照組比較,*P＜0.05。圖2 不同時間點不同直腸擴張壓力下各組大鼠AWR 的比較( xˉ± s, n =10)Note. Compared with Control group,*P＜0.05.Figure 2 Comparison of AWR of rats in different groups under different rectal dilatation pressure at different time points( xˉ± s, n =10)

表5 不同時間點各組大鼠內(nèi)臟痛閾值的比較( , n =10, mmHg)Table 5 Comparison of visceral pain thresholds of rats in different groups at different time points( , n =10,mmHg)

表5 不同時間點各組大鼠內(nèi)臟痛閾值的比較( , n =10, mmHg)Table 5 Comparison of visceral pain thresholds of rats in different groups at different time points( , n =10,mmHg)

組別Groups 5 周齡5 weeks 7 周齡7 weeks 9 周齡9 weeks 11 周齡11 weeks母嬰分離組Neonatal maternal separation group 69.67 ± 10.83 68.67 ± 7.40 55.67 ± 12.77*▲ 74.67 ± 4.77不可預(yù)測性母嬰分離組Unpredictable neonatal maternal separation group 72.00 ± 4.21 66.00 ± 15.78 76.80 ± 5.18 75.97 ± 4.66空白對照組Control group 74.00 ± 5.16 75.00 ± 8.18 76.90 ± 8.18 73.00 ± 6.75

注：中性粒細胞(↑);淋巴細胞浸潤(↑)。圖3 各組結(jié)腸組織病理光鏡觀察圖(× 400,標尺=100 μm)Note. Neutrophils (↑). Lymphocyte infiltration (↑).Figure 3 Pathological observation of colonic tissue in each group (× 400, Scale bar=100 μm)

從本研究的結(jié)果可以看出,母嬰分離法與不可預(yù)測性母嬰分離法均可復(fù)制IBS 模型,但各自的側(cè)重點不同,從大便情況來看,與母嬰分離組及空白對照組比較,不可預(yù)測性母嬰分離組大鼠大便顆數(shù)更多,多為軟稀便,且糞便含水量增加更多,這說明與其余兩組相比,不可預(yù)測性母嬰分離模型更符合制作腹瀉型IBS 模型。 而從IBS 內(nèi)臟高敏測定上,與空白對照組和不可預(yù)測性母嬰分離組大鼠比較,5～9 周齡期間,母嬰分離組大鼠的AWR 評分最高,這說明母嬰分離組的內(nèi)臟高敏程度高于其余兩組,更適合制作IBS 內(nèi)臟高敏模型。 從IBS 內(nèi)臟高敏持續(xù)性測定可以看出,內(nèi)臟高敏狀態(tài)具有時間依賴性。 在造模后,大鼠呈現(xiàn)出內(nèi)臟高敏狀態(tài),且在9 周齡時達到峰值,而在大鼠11 周齡時有所下降。 這一現(xiàn)象提示在研究IBS 幼鼠模型內(nèi)臟高敏狀態(tài)時,應(yīng)嚴格注意時間。 造模后,模型在9 周齡之前呈現(xiàn)出穩(wěn)定的內(nèi)臟高敏狀態(tài),在這之后便出現(xiàn)內(nèi)臟高敏自愈傾向。 同時,這一現(xiàn)象也提示在研究相關(guān)干預(yù)措施對內(nèi)臟高敏狀態(tài)的治療作用中,應(yīng)該充分考慮模型自愈可能帶來的效力評價準確性、客觀性問題。從實驗結(jié)果可以看出,幼鼠在造模結(jié)束后,內(nèi)臟高敏感性僅能維持到成年后3 周內(nèi),而幼鼠模型需在其成年后(即8 周齡)才能施加干預(yù)措施,因此我們在造模后施加干預(yù)措施時,應(yīng)在幼鼠模型成年后3周以內(nèi)施加,才能準確觀測到干預(yù)措施對模型內(nèi)臟高敏狀態(tài)的影響。

綜上所述,母嬰分離法及不可預(yù)測性母嬰分離法均可模擬IBS 內(nèi)臟高敏模型,但各具優(yōu)劣及其適合的研究癥狀。 此外,本研究發(fā)現(xiàn)幼鼠模型內(nèi)臟高敏狀態(tài)存在時間依賴性,最佳研究時間為大鼠9 周齡以內(nèi)。 本研究創(chuàng)新性的制作不可預(yù)測性母嬰分離模型,彌補了傳統(tǒng)母嬰分離模型分離時間存在耐受性不足,并且觀察了該模型的內(nèi)臟高敏持續(xù)性,這在前期文獻研究中鮮有研究及說明,對今后該疾病的模型評價及干預(yù)措施研究提供證據(jù)。

然而本研究尚存在一些不足,在研究中僅對模型的一般情況、大便性狀、內(nèi)臟敏感性及腸道病理情況進行測定,未針對模型的心理狀態(tài)進行深入研究,在后期研究中可以增加高架十字迷宮、曠場試驗等動物模型精神行為學(xué)的檢測,以檢測母嬰分離模型及不可預(yù)測性母嬰分離模型對幼鼠的精神活動有無影響。 另外,使用腹壁撤退反射評分及內(nèi)臟痛閾值進行內(nèi)臟高敏評價具有一定的主觀性,因此在后期可加入腹壁肌電活動或脊髓誘發(fā)電位等檢測對內(nèi)臟敏感性測定有更為客觀的評價。 本文對通過不同方法制作IBS 內(nèi)臟高敏幼鼠模型,并對其內(nèi)臟高敏情況及模型持續(xù)性進行了評價,為今后IBS 內(nèi)臟高敏模型的建立、運用及治療評價等基礎(chǔ)研究提供思路。